本发明专利技术公开了一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒，所述试剂盒含有酶反应体系，通过在酶反应体系下进行扩增反应，用于确定待测样品中是否存在新型冠状病毒的核酸。本发明专利技术检测试剂盒具有操作便捷、检测速度快、灵敏度高等优点，只需采用简单的控温装置即可以实施，非常适于广泛应用检测部门推广使用，可以加快疑似病例患者和密切接触人群检测速度，同时最大限度地避免当前由检测灵敏度低引致的漏检问题。避免当前由检测灵敏度低引致的漏检问题。
【技术实现步骤摘要】
一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒
[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒。
技术介绍
[0002]核酸检测涉及到提取、扩增、检测等环节，对实验室环境和操作人员要求较高，一个完整的新冠病毒核酸检测程序往往需要专业测试人员连续3小时以上的双手离台操作，涉及大型的荧光定量PCR仪，因此核酸检测的普及和现场应用受到限制，进而导致了大量疑似病例患者和密切接触人群不能够及时得到确诊，同时由于某些方法由于反应体系灵敏度较低容易造成检测结果的假阴性从而出现漏检问题。因此有必要开发一种操作便捷、检测快速、灵敏度高的新型冠状病毒检测反应体系/试剂盒。
[0003]环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是近年来发展起来的一种新型等温核酸扩增方法，该法针对靶序列的6个区域设计特异性引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在等温条件保温约60 min，即可完成核酸扩增反应。该技术具有不需要PCR仪或荧光定量PCR仪、等温下即可完成，肉眼即可判断反应结果，以及操作便捷、检测时间短、灵敏度高、特异性强等优点。新冠疫情爆发后，研究人员基于LAMP原理研制了新冠病毒的检测方法，如Yinhua Zhang et al. (2020)[文献见：Rapid Molecular Detection of SARS-CoV-2 (COVID-19) Virus RNA Using Colorimetric LAMP. doi: https://doi.org/10.1101/2020.02.26.20028373 ]以新型冠状病毒的ORF和N基因设计了LAMP扩增引物，其中检测灵敏度较高的包含引物组NA的反应体系最低可检测到120拷贝的RNA。为了进一步提高检测灵敏度，降低假阴性和漏检率，本专利技术对其反应体系作了进一步优化。
技术实现思路
[0004]本专利技术的目的在于：提供一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒。
[0005]本专利技术的又一目的在于：提供上述检测试剂盒检测新型冠状病毒的核酸的应用。
[0006]本专利技术目的通过下述方案实现：一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒，含有酶反应体系，通过在酶反应体系下进行扩增反应，确定待测样品中是否存在新型冠状病毒的核酸；所述的酶反应体系中至少包括扩增引物中的第一引物组、第二引物组或者第三引物组中的一组；所述的第一引物组含有上游外引物F3：5
’-
TGGCTACTACCGAAGAGCT-3
’ꢀ
(SEQ ID NO：1)和S下游外引物B3：5
’-
TGCAGCATTGTTAGCAGGAT-3
’ꢀ
(SEQ ID NO：2)；所述的第二引物组含有上游内引物FIP：5
’-
TCTGGCCCAGTTCCTAGGTAGTCCAGACGAATTCGTGGTGG-3
’ꢀ
(SEQ ID NO：3)和下游内引物BIP：5
’-
AGACGGCATCATATGGGTTGCACGGGTGCCAATGTGATCT-3
’
(SEQ ID NO：4)；所述的第三引物组含有上游环引物LF：5
’-
GGACTGAGATCTTTCATTTTACCGT-3
’
(SEQ ID NO：5)和上游环引物LF：5
’-ꢀ
ACTGAGGGAGCCTTGAATACA
ꢀ-3’ꢀ
(SEQ ID NO：6)。
[0007]本专利技术通过LAMP反应体系/试剂的优化，克服当前新型冠状病毒分子检测领域中所遇到的由于操作复杂、检测时间长而造成大量疑似病例患者和密切接触人群不能够及时得到确诊，以及由于反应体系灵敏度较低易造成检测结果呈假阴性从而出现漏检的问题。
[0008]本专利技术通过LAMP反应体系/试剂的优化，克服当前新型冠状病毒分子检测领域中所遇到的由于操作复杂、检测时间长而造成大量疑似病例患者和密切接触人群不能够及时得到确诊，以及由于反应体系灵敏度较低易造成检测结果呈假阴性从而出现漏检的问题。
[0009]本专利技术所优化的LAMP反应体系制备的试剂盒，操作简便、检测时间短，灵敏度高，降低了假阴性和漏检率。
[0010]为了进一步提高检测灵敏度，降低假阴性和漏检率，本专利技术对其反应体系作了进一步优化，并在此基础上完成本专利技术。
[0011]较好的，所述的酶反应体系还包括Bst DNA聚合酶反应缓冲液、Mg
2+
、甜菜碱、dNTP、Bst DNA聚合酶中的一种或者几种。
[0012]更好的，所述的试剂盒酶反应体系还包括逆转录酶。例如，所述逆转录酶包括AMV酶。
[0013]更好的，新型冠状病毒核酸的检测试剂盒还含有显色剂；所述的显色剂选自：Sybr Green I、Genefinder或GelRed。
[0014]较好的，所述试剂盒包括酶反应体系和显色剂，通过在酶反应体系下进行等温扩增反应，通过显色剂辅助判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在新型冠状病毒。
[0015]在本专利技术的一个优选实施例中，所述试剂盒酶反应体系包括Bst DNA聚合酶反应缓冲液、Mg
2+
、甜菜碱、dNTP、引物、Bst DNA聚合酶和逆转录酶。
[0016]本专利技术所述的试剂盒中，各组分的浓度为工作浓度，在保存、运输的过程中，各组分的浓度可为工作浓度的2～100倍。各组分可以独立存在也可以预混合存在，例如，所述试剂盒包括缓冲液、酶和显色剂三个独立存在的试剂，其中预混试剂缓冲液包括Bst DNA聚合酶反应缓冲液、Mg
2+
、甜菜碱和dNTP、引物F3、B3、FIP、BIP、LF和LB，预混试剂酶包括Bst DNA聚合酶和逆转录酶；也可以包括缓冲液、引物、酶和显色剂四个独立存在的试剂，其中预混试剂缓冲液包括Bst DNA聚合酶反应缓冲液、Mg
2+
、甜菜碱、dNTP，预混试剂引物包括F3、B3、FIP、BIP、LF和LB，预混试剂酶包括Bst DNA聚合酶和逆转录酶。
[0017]在本专利技术的一个优选实施例中，提供了一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒，所述试剂盒酶反应体系包括：1
×
Bst DNA聚合酶反应缓冲液，6 mmol/L Mg
2+
，0.6 mol/L的甜菜碱、1.2 mmol/L dNTP，浓度分别为0.2 μmol/L的F3和B3引物，浓度分别为1.6 μmol/L的FIP和BIP引物，浓度分别为0.4 μmol/L的LF和LB引物，0.3～0.4U/ μL Bst DNA聚合酶，0.06～0.08 U/ μL逆转录酶。
[0018]其中，1
×ꢀ
Bst DNA聚合酶反应缓冲液可以选用1
×
Thermopol反应缓冲液，包含20mmol/L Tris-HC本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述新型冠状病毒核酸检测试剂盒含有酶反应体系，通过在酶反应体系下进行扩增反应，确定待测样品中是否存在新型冠状病毒的核酸；所述的酶反应体系中至少包括扩增引物中的第一引物组、第二引物组或者第三引物组中的一组；所述的第一引物组含有上游外引物F3：5
’-
TGGCTACTACCGAAGAGCT-3
’ꢀ
(SEQ ID NO：1)和S下游外引物B3：5
’-
TGCAGCATTGTTAGCAGGAT-3
’ꢀ
(SEQ ID NO：2)；所述的第二引物组含有上游内引物FIP：5
’-
TCTGGCCCAGTTCCTAGGTAGTCCAGACGAATTCGTGGTGG-3
’ꢀ
(SEQ ID NO：3)和下游内引物BIP：5
’-
AGACGGCATCATATGGGTTGCACGGGTGCCAATGTGATCT-3
’
(SEQ ID NO：4)；所述的第三引物组含有上游环引物LF：5
’-
GGACTGAGATCTTTCATTTTACCGT-3
’
(SEQ ID NO：5)和上游环引物LF：5
’-ꢀ
ACTGAGGGAGCCTTGAATACA
ꢀ-3’ꢀ
(SEQ ID NO：6)。2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的酶反应体系还包括Bst DNA聚合酶反...
【专利技术属性】
技术研发人员：崔大祥，李雪玲，田静，徐艳，陈晓敏，刘泽熙，梁辉，
申请(专利权)人：上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。