FRT细胞株在制备筛选Piezo1调节剂的制剂或试剂盒中的应用制造技术

本发明专利技术涉及生物医药领域，特别涉及FRT细胞株在制备筛选Piezo1调节剂的制剂或试剂盒中的应用。RT

【技术实现步骤摘要】
FRT细胞株在制备筛选Piezo1调节剂的制剂或试剂盒中的应用


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，特别涉及FRT细胞株在制备筛选Piezo1调节 剂的制剂或试剂盒中的应用。

技术介绍

[0002]2010年末，PATAPOUTIAN教授等发现了受机械力刺激并促使钙离子内 流的机械压电通道Fam38A和Fam38B，并命名为Piezo1、Piezo2，之后相关 研究快速成为热门，两种通道生理功能也逐渐清晰。机械压电通道Piezo在多 种哺乳动物内皮细胞中均有表达，其中Piezo1能够接受牵拉或按压的机械刺 激并引发细胞外Ca
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内流，进而参与一系列非常重要的生理功能。有研究发 现，Piezo1在血管及淋巴管发育、血压调控、红细胞体积调控中起到了重要 的作用，抑制Piezo1的表达会导致淋巴管发育不良，溶血性贫血。Piezo1通 道具有一系列重要的生理作用，因此具有较高的研究价值，Piezo1的特异性 调节剂在相关研究中发挥重要的作用。研究表明，虽然Yoda1和Jedi1，Jedi2 可以特异性地激活Piezo1通道，但是Yoda1作为激活剂激活作用周期长，而 Jedi1，Jedi2与Piezo1结合亲和力较低，需要较高浓度的Jedi才能引起激活。 现有的抑制剂Gd
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和钌红(ruthenium Red，RR)均是广谱钙离子通道抑制剂， 缺乏特异性。因此，如何高通量筛选Piezo1的特异性调节剂是深入研究Piezo1 通道亟待解决的问题。
[0003]电生理技术是研究离子通道的金标准，可以用于离子通道调节剂的筛选。 但是此方法不仅需要特定的仪器设备，对技术人员也有很高的要求，不适合 用于通量筛选激活剂和抑制剂的方法。也有研究者使用放射性离子和阴离子 敏感的荧光染料以及化学发光的方法筛选激活剂和抑制剂，但是也需要特殊 材料和复杂的技术，且局限性较强，同时，一次实验后还要重新制备样品， 限制了方法的推广和应用。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术构建了基于钙激活氯离子通道蛋白1(ANO1)的Piezo1 调节剂高通量筛选模型。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0006]本专利技术提供了FRT细胞株在制备筛选Piezo1调节剂的制剂或试剂盒中的 应用；所述FRT细胞株中ANO1和YFP-H148Q/I152L共表达；
[0007]所述FRT细胞株通过荧光信号反应细胞内Ca
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浓度的变化进而筛选 Piezo1通道调节剂，细胞内Ca
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浓度对Piezo1激活剂呈浓度依赖关系；
[0008]所述荧光信号为相对荧光强度变化值/slope值/斜率值；
[0009]其中，所述相对荧光强度变化值/slope值/斜率值与细胞内Ca
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浓度呈现 良好的正相关；
[0010]所述相对荧光强度变化值/slope值/斜率值计算如下：
[0011][0012]0s～1.4s的相对荧光值的平均值；
[0013]y：2.4s～14.8s与0.6s～13s做线性回归分析所得到的线性回归的结果。
[0014]钙激活氯离子通道蛋白1(anoctamin-1，ANO1)作为一种钙激活氯离子 通道(calcium-activated chloride channel，CaCC)能够在Ca
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的作用下开放并 向胞浆中转运Cl-、I-等卤素阴离子，但是细胞内外均含有大量Cl-，细胞内Cl-会在一定程度影响检测结果，而不同于细胞内丰富的Cl-，I-在细胞内外含量 极低，选用I-进行实验具有干扰低易控制的优点。黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein,YFP)可在细胞内长久表达，其相对荧光强度高，YFP具 有多种突变体，有遇卤素离子淬灭的特性，不同的突变体对不同的卤素离子 敏感，其中双突变体YFP-H148Q/I152L对I-具有极高的亲和力，基于此原理， 本研究通过构建共表达ANO1-EGFP和YFP-H148Q/I152L的Fischer大鼠甲状 腺上皮(Fischer rat thyroid，FRT)细胞，构建可用于研究Piezo1通道生理功 能的高通量筛选模型，当Piezo1通道被激活时，内流的Ca
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引起CaCC开放， 细胞外的I-内流可以引起YFP-H148Q/I152L淬灭。模型模式图如图1。本模型 可反复传代，重复性好，经济，快捷，可以敏感地反应细胞内钙信号的变化， 为Piezo1通道激活剂、抑制剂的筛选提供更加优秀的解决方案，以及为其他 Ca
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通道的调节剂高通量筛选方法的建立提供新的思路。
[0015]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述FRT细胞株的构建方法为：构建 钙激活氯离子通道ANO1和对卤族元素敏感的黄色荧光蛋白双突变体 YFP-H148Q/I152L真核表达载体，经脂质体转染、抗生素筛选和稀释，获取 共表达ANO1和YFP-H148Q/I152L的FRT细胞。
[0016]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述Piezo1调节剂包括Jedi1，Jedi2 或Yoda1。
[0017]本专利技术提供了FRT细胞株在检测细胞内游离钙离子浓度中的应用；所述 FRT细胞株中ANO1和YFP-H148Q/I152L共表达；
[0018]所述FRT细胞株通过荧光信号反应细胞内Ca
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浓度的变化进而筛选 Piezo1通道调节剂，细胞内Ca
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浓度对Piezo1激活剂呈浓度依赖关系；
[0019]所述荧光信号为相对荧光强度变化值/slope值/斜率值；
[0020]其中，所述相对荧光强度变化值/slope值/斜率值与细胞内Ca
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浓度呈现 良好的正相关；
[0021]所述相对荧光强度变化值/slope值/斜率值计算如下：
[0022][0023]0s～1.4s的相对荧光值的平均值；
[0024]y：2.4s～14.8s与0.6s～13s做线性回归分析所得到的线性回归的结果。
[0025]本专利技术提供了FRT细胞株在制备检测细胞内游离钙离子浓度的制剂或试 剂盒中的应用；所述FRT细胞株中ANO1和YFP-H148Q/I152L共表达。
[0026]本专利技术提供了FRT细胞株在制备预防和/或治疗与Piezo1通道相关疾病的 药物中的应用；所述FRT细胞株中ANO1和YFP-H148Q/I152L共表达；
[0027]所述FRT细胞株通过荧光信号反应细胞内Ca
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浓度的变化进而筛选 Piezo1通道调节剂，细胞内Ca
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浓度对Piezo1激活剂呈浓度依赖关系；
(slope)值。加入Piezo1调节剂应用荧光淬灭动力学实验检测FRT模型细胞 slope值，加入Piezo1激活剂，应用荧光淬灭动力学本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.FRT细胞株在制备筛选Piezo1调节剂的制剂或试剂盒中的应用；所述FRT细胞株中ANO1和YFP-H148Q/I152L共表达；所述FRT细胞株通过荧光信号反应细胞内Ca
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浓度的变化进而筛选Piezo1通道调节剂，细胞内Ca
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浓度对Piezo1激活剂呈浓度依赖关系；所述荧光信号为相对荧光强度变化值/slope值/斜率值；其中，所述相对荧光强度变化值/slope值/斜率值与细胞内Ca
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浓度呈现良好的正相关；所述相对荧光强度变化值/slope值/斜率值计算如下：所述相对荧光强度变化值/slope值/斜率值计算如下：0s～1.4s的相对荧光值的平均值；y：2.4s～14.8s与0.6s～13s做线性回归分析所得到的线性回归的结果。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Piezo1调节剂包括Jedi1，Jedi2或Yoda1。3.FRT细胞株在制备预防和/或治疗与Piezo1通道相关疾病的药物中的应用；所述FRT细胞株中ANO1和YFP-H148Q/I152L共表达；所述FRT细胞株通过荧光信号反应细胞内Ca
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浓度的变化进而筛选Piezo1通道调节剂，细胞内Ca
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浓度对Piezo1激活剂呈浓度依赖关系；所述荧光信号为相对荧光强度变化值/slope值/斜率值；其中，所述相对荧光强度变化值/slope值/斜率值与细胞内Ca
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浓度呈现良好的正相关；所述相对荧光强度变化值/slope值/斜率值计算如下：所述相对荧光强度变化值/slope值/斜率值计算如下：0s～1.4s的相对荧光值的平均值；y：2.4s～14.8s与0.6s～13s做线性回归分析所得到的线性回归的结果。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡城，郝峰，杨娟，王坤，李颖卓，丁旭，解宇浩，张嘉琪，
申请(专利权)人：吉林医药学院，
类型：发明
国别省市：