FRT细胞株在制备筛选CFTR调节剂的制剂或试剂盒中的应用制造技术

本发明专利技术涉及生物医药领域，特别涉及FRT细胞株在制备筛选CFTR调节剂的制剂或试剂盒中的应用。倒置荧光显微镜下观察到CFTR表达在细胞膜上，YFP

【技术实现步骤摘要】
FRT细胞株在制备筛选CFTR调节剂的制剂或试剂盒中的应用


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，特别涉及FRT细胞株在制备筛选CFTR调节剂的制剂或试剂盒中的应用。

技术介绍

[0002]第二信使是细胞内的信号转导的启动组成部件之一，主要包括：环腺苷酸(cAMP)、环磷酸鸟苷(cGMP)、钙离子(Ca
2+
)、肌醇三磷酸(IP3)、甘油二酯(DAG)等。cAMP作为胞浆内重要的第二信使，可调控细胞内诸多重要的生理过程，如参与细胞的增值与分化、激素的合成与分泌、基因表达、信号转导、神经节突触传递的调节等。胞浆内cAMP也参与许多病理过程，是治疗心脏病、急性白血病、慢性呼吸道疾病、某些肿瘤等疾病的潜在靶点。因此，胞浆内第二信使cAMP一直是科研领域的研究热点。目前，检测胞浆内cAMP的方法主要有报告基因检测法、竞争法、放射性标记法等。报告基因检测法缺点是蛋白的半衰期较短，常规分析的重复性差。竞争法缺点是操作繁琐，试剂耗费高。放射性标记法缺点是需要特定的仪器设备，对操作人员技术要求高，对操作人员可能有潜在风险。

技术实现思路

[0003]有鉴于此，本专利技术建立了一种基于CFTR可敏感检测胞浆内第二信使cAMP的细胞模型。
[0004]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0005]本专利技术还提供了FRT细胞株在检测胞浆内cAMP浓度的应用；所述FRT细胞株中ANO1和YFP-H148Q/I152L共表达；
[0006]其中，相对荧光强度变化值/slope值/斜率值与细胞内cAMP浓度呈现良好的正相关；
[0007]所述相对荧光强度变化值/slope值/斜率值计算如下：
[0008][0009]0s～1.4s的相对荧光值的平均值；
[0010]y：2.4s～14.8s与0.6s～13s做线性回归分析所得到的线性回归的结果。
[0011]本专利技术还提供了FRT细胞株在制备检测胞浆内cAMP浓度的制剂或试剂盒中的应用；所述FRT细胞株中ANO1和YFP-H148Q/I152L共表达；
[0012]其中，相对荧光强度变化值/slope值/斜率值与细胞内cAMP浓度呈现良好的正相关；
[0013]所述相对荧光强度变化值/slope值/斜率值计算如下：
[0014][0015]0s～1.4s的相对荧光值的平均值；
[0016]y：2.4s～14.8s与0.6s～13s做线性回归分析所得到的线性回归的结果。
[0017]本专利技术还提供了FRT细胞株在制备预防和/或治疗与胞浆内cAMP相关疾病的药物中的应用；所述FRT细胞株中ANO1和YFP-H148Q/I152L共表达；
[0018]其中，相对荧光强度变化值/slope值/斜率值与细胞内cAMP浓度呈现良好的正相关；
[0019]所述相对荧光强度变化值/slope值/斜率值计算如下：
[0020][0021]0s～1.4s的相对荧光值的平均值；
[0022]y：2.4s～14.8s与0.6s～13s做线性回归分析所得到的线性回归的结果。
[0023]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述与胞浆内cAMP相关疾病包括心脏病、急性白血病、慢性呼吸道疾病、肿瘤中的一种或多种。
[0024]本专利技术还提供了检测胞浆内cAMP浓度的制剂或试剂盒，包括FRT细胞株以及可接受的助剂；所述FRT细胞株中ANO1和YFP-H148Q/I152L共表达；
[0025]其中，相对荧光强度变化值/slope值/斜率值与细胞内cAMP浓度呈现良好的正相关；
[0026]所述相对荧光强度变化值/slope值/斜率值计算如下：
[0027][0028]0s～1.4s的相对荧光值的平均值；
[0029]y：2.4s～14.8s与0.6s～13s做线性回归分析所得到的线性回归的结果。
[0030]本专利技术提供了FRT细胞株在制备筛选CFTR调节剂的制剂或试剂盒中的应用；所述FRT细胞株中ANO1和YFP-H148Q/I152L共表达；
[0031]所述FRT细胞株通过荧光信号反应细胞内cAMP浓度的变化进而筛选CFTR调节剂；
[0032]所述荧光信号为相对荧光强度变化值/slope值/斜率值，所述相对荧光强度变化值/slope值/斜率值与CFTR调节剂浓度成剂量依赖关系；
[0033]其中，相对荧光强度变化值/slope值/斜率值与细胞内cAMP浓度呈现良好的正相关；
[0034]所述相对荧光强度变化值/slope值/斜率值计算如下：
[0035][0036]0s～1.4s的相对荧光值的平均值；
[0037]y：2.4s～14.8s与0.6s～13s做线性回归分析所得到的线性回归的结果。
[0038]囊性纤维化跨膜传导调节因子(Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator，CFTR)是一种具有门控性的cAMP依赖的氯离子通道蛋白，它可以反映细胞内第二信使cAMP的浓度改变，当胞浆内cAMP浓度升高，可敏感激活CFTR通道，使CFTR通道开放。YFP-H148Q/I152L是对卤族元素敏感的黄色荧光蛋白双突变体，具有遇到I-会发生淬灭的特性。当胞浆内cAMP浓度升高时，CFTR通道开放，可将细胞外I-转运到胞浆内，使黄色荧光蛋白的荧光发生淬灭，因此YFP-H148Q/I152L相当于一个可检测CFTR是否开放的生物传感器。本研究利用此原理构建稳定共转染CFTR和YFP-H148Q/I152L的Fischer大鼠甲状腺滤泡上皮(Fischer rat thyroid，FRT)细胞模型作为基于CFTR的胞浆内第二信使cAMP检测方
法，测定原理如图1所示。该模型可敏感检测胞浆内cAMP浓度的变化，通过荧光斜率值反映细胞内cAMP浓度的变化，具有灵敏度高、重复性好、适用性广等特点。本研究解决了以往检测cAMP方法价格昂贵、重复性差、操作繁琐等问题，具有检测灵敏、操作简便、试剂耗费低的优点。本研究不仅可以简便快速地检测胞浆内cAMP浓度，还为基于CFTR信号通路的第二信使cAMP相关靶点提供了筛选平台，为第二信使cAMP信号转导途径的研究奠定了良好的基础。
[0039]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述FRT细胞株的构建方法为：构建钙激活氯离子通道ANO1和对卤族元素敏感的黄色荧光蛋白双突变体YFP-H148Q/I152L真核表达载体，经脂质体转染、抗生素筛选和稀释，获取共表达ANO1和YFP-H148Q/I152L的FRT细胞。
[0040]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述CFTR调节剂包括激活剂或抑制剂；所述激活剂包括imperatorin、genistein、forskolin或IBMX中的一种或多种；所述抑制剂包括Gly H101或CFTRinh-172。
[0041]本专利技术还提供了筛选CFTR本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.FRT细胞株在制备预防和/或治疗与胞浆内cAMP相关疾病的药物中的应用；所述FRT细胞株中ANO1和YFP-H148Q/I152L共表达；其中，相对荧光强度变化值/slope值/斜率值与细胞内cAMP浓度呈现良好的正相关；所述相对荧光强度变化值/slope值/斜率值计算如下：所述相对荧光强度变化值/slope值/斜率值计算如下：：0s～1.4s的相对荧光值的平均值；y：2.4s～14.8s与0.6s～13s做线性回归分析所得到的线性回归的结果。2.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述与胞浆内cAMP相关疾病包括心脏病、急性白血病、慢性呼吸道疾病、肿瘤中的一种或多种。3.FRT细胞株在制备筛选CFTR调节剂的制剂或试剂盒中的应用；所述FRT细胞株中ANO1和YFP-H148Q/I152L共表达；所述FRT细胞株通过荧光信号反应细胞内cAMP浓度的变化进而筛选CFTR调节剂；所述荧光信号为相对荧光强度变化值/slope值/斜率值，所述相对荧光强度变化值/slope值/斜率值与CFTR调节剂浓度成剂量依赖关系；其中，相对荧光强度变化值/slope值/斜率值与细胞内cAMP浓度呈现良好的正相关；所述相对荧光强度变化值/slope值/斜率值计算如下：所述相对荧光强度变化值/slope值/斜率值计算如下：：0s～1.4s的相对荧光值的平均值；y：2.4s～14.8s与0.6s～13s做线性回归分析所得到的线性回归的结果。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述CFTR调节剂包括激活剂或抑制剂；所述激活剂包括imperatorin、genistein、forskolin或IBMX中的一种或多种；所述抑制...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝峰，杨敬研，姜琳，郑锴，解宇浩，张嘉琪，
申请(专利权)人：吉林医药学院，
类型：发明
国别省市：