一类具有标记功能用于超分辨成像的亚硝基笼化罗丹明衍生物及应用，这类亚硝基笼化罗丹明衍生物提供三种罗丹明母体结构，将对细胞结构有特定靶向的分子连接的罗丹明上，通过改变对细胞结构有特定靶向的分子的结构能够实现对细胞内线粒体、内质网、细胞核、微管等不同亚细胞器的特定标记以及超分辨成像。通过特定的靶向标记实现对细胞内不同细胞器的标记，通过超分辨成像获得高分辨率的超分辨图像，更为细致、完整的重构出细胞内各个细胞器的结构细节及生理过程，为在纳米级上观察细胞内各细胞器的结构及生理过程提供一类工具。器的结构及生理过程提供一类工具。器的结构及生理过程提供一类工具。
【技术实现步骤摘要】
一类具有标记功能用于超分辨成像的亚硝基笼化罗丹明衍生物及应用
[0001]本专利技术涉及一类具有标记功能用于超分辨成像的亚硝基笼化罗丹明衍生物及应用，属于精细化工领域。
技术介绍
[0002]超分辨成像技术由于其在细胞成像上打破了传统光学显微镜的光学衍射极限(200nm)，因此被科学家广泛的关注并应用其观察更多的细胞内各细胞器结构及了解生理活动过程的更多细节。超分辨成像对荧光染料有着较高的要求，不仅要求染料具有较高的荧光亮度、稳定性、膜通透性，还要求染料具有优异的特异性。因此，目前能真正用于超分辨成像上的染料仍较为匮乏。在已应用于超分辨成像上的染料中，笼化罗丹明可作为一类具有突出性能的优异染料，科学家们也在不断的对笼化罗丹明进行改进以进一步提高笼化罗丹明的成像性能。常用的笼化基团为邻硝基苄基基团，该基团可连接到罗丹明母体上并使罗丹明处于螺环形式无荧光发射，当被光照射或生理条件刺激下可将邻硝基苄基基团脱落释放出荧光，实现从无荧光发射到有荧光发射的一个转变，这种差异对于超分辨成像是有利的。但邻硝基苄基笼化的罗丹明通常需要紫外光来对其进行激活，紫外光的应用增加了光毒性以及成像时细胞的自发荧光信号，因此如何避免使用紫外光激活笼化型罗丹明也是一项挑战。
[0003]杨有军课题组第一次将亚硝基笼化策略应用到罗丹明染料上。该策略简化了笼化基团并可实现超分辨成像。但其只能对罗丹明染料在细胞内本身所聚集的结构进行标记成像，无法对细胞内其他结构进行标记及成像。
技术实现思路
[0004]本专利技术利用亚硝基笼化罗丹明可进行超分辨成像的优点，通过羧基、溴取代增加其衍生位点，通过羧基与氨基的缩合反应或偶联反应将对细胞结构有特定靶向的分子连接到罗丹明上，可以实现对细胞内线粒体、内质网、细胞核、微管等不同亚细胞器的特定标记以及超分辨成像，实现了在纳米级上观察细胞内各细胞器的结构及生理过程。
[0005]本专利技术提供一类具有标记功能用于超分辨成像的亚硝基笼化罗丹明衍生物，该衍生物具有如下结构通式：
[0006][0007]其中，x＝O、C(CH3)2或者Si(CH3)2。
[0008]R1各自独立的为
--
C
n
H
2n+1
、
--
C
n
H
2n
COOH、
--
C
n
H
2n
SO3H或与同侧N原子、R2和苯环上碳
原子构成的六元环状结构。
[0009]R2各自独立的为H或CH3。
[0010]R3为为其中：X-为阴离子，所述阴离子为BF
4-、Cl-、Br-、I-、NO
3-、SO
42-、ClO
4-、CH3COO-、CH3SO
3-或CF3SO
3-，所带正电荷总数等于阴离子X-所带负电荷总数。
[0011]R4为
--
C
n
H
2n+1
或与同侧N原子及苯环上碳原子构成的六元环状结构。
[0012]其中：n各自独立的为0-18的整数，m各自独立的为0-18的整数。
[0013]R5各自独立的为各自独立的为各自独立的为R5各自独立的取代苯环上4位或5位的碳原子。
[0014]所述的一类具有标记功能用于超分辨成像的亚硝基笼化罗丹明衍生物用于特异性标记亚细胞结构并对所标记的亚细胞结构进行超分辨成像；
[0015]时，该衍生物可通过免疫标记方法标记到细胞内各特异性蛋白结构上，实现相应蛋白结构的成像。
[0016]时，该衍生物可标记通过融合蛋白技术转染表达
Halo蛋白的细胞，实现相应蛋白结构的成像。
[0017]时，该衍生物可标记通过融合蛋白技术转染表达SNAP蛋白的细胞，实现相应蛋白结构的成像。
[0018]时,该衍生物可标记通过融合蛋白技术转染表达CLIP蛋白的细胞，实现相应蛋白结构的成像。
[0019]时,该衍生物可通过生物正交技术，与相应的具有标记底物的环辛炔/环辛烯反应进而标记到相应的亚细胞器上，实现相应结构的成像。
[0020]时,该衍生物可通过生物正交技术，与相应的具有标记底物的环辛炔/环辛烯反应进而标记到相应的亚细胞器上，实现相应结构的成像。
[0021]时,该衍生物用于活细胞线粒体成像。
[0022]时,该衍生物用于活细胞溶酶体成像。
[0023]时,该衍生物用于细胞核成像。
[0024]时,该衍生物用于细胞肌动蛋白成像。
[0025]时,该衍生物用于细胞膜成像。
[0026]时,该衍生物用于细胞内质网成像。
[0027]时,该衍生物用于细胞高尔基体成像。
[0028]时,该衍生物用于细胞微管成像。
[0029]本专利技术中，所述一类具有标记功能用于超分辨成像的亚硝基笼化罗丹明衍生物的制备流程如下：
[0030]根据文献报道方法，首先合成具有羧基、溴等衍生基团的罗丹明，将羧基取代罗丹明笼化成亚硝基罗丹明，再将亚硝基笼化罗丹明与对细胞结构有特定靶向的分子连接，或者将溴代罗丹明与对细胞结构有特定靶向的分子连接再将该分子笼化成亚硝基罗丹明，最终获得对细胞内各细胞器具有特异性标记能力的亚硝基笼化罗丹明。合成方法如下式所示：
[0031][0032]其中，R1、R2、R3、R4和R5的定义同结构通式中的定义，羧基和溴取代苯环上4位或5位上的碳原子，
[0033]本专利技术中的亚硝基笼化罗丹明在超分辨成像上的应用流程如下：培养细胞：先将细胞转移至玻片上，待细胞繁殖至玻片面积的80％左右进行染色。细胞染色过程：将亚硝基笼化罗丹明母液用培养基稀释至1uM，替换原细胞培养基，染色30min后，PBS洗去多余染料，替换成无酚红培养基，进行超分辨成像。
[0034]本专利技术的有益效果：一类具有标记功能用于超分辨成像的亚硝基笼化罗丹明衍生物及应用，该类亚硝基笼化罗丹明衍生物由于其本身为无荧光状态，只有在被光照射后才能释放出罗丹明母体荧光，因此其在进行单分子定位超分辨成像时，无需提前对其进行漂白，可直接进行成像以最大程度收集染料分子所发出的光子，提高了染料的利用率。并且，通过连接具有不同标记功能的基团R5实现对不同细胞微结构进行特异性的标记，对其进行可视化研究，例如，通过羧基对特性抗体进行标记，通过四嗪基团与相应环辛炔/环辛炔底
物反应实现不同的标记目的。该类亚硝基笼化罗丹明的超分辨成像效果优异，分辨率高，适用于不同结构成像，对细胞内各结构的生理过程研究有重要的应用前景。这类亚硝基笼化罗丹明衍生物提供三种罗丹明母体结构，将羧基或溴等可进行进一步衍生的基团连接到了亚硝基笼化罗丹明上，再通过羧基与氨基的缩合反应或偶联反应将对细胞结构有特定靶向的分子连接的罗丹明上，通过改变对细胞结构有特定靶向的分子的结构能够实现对细胞内线粒体、内质网、细胞核、微管等不同亚细胞器的特定标记以及超分辨成像。通本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一类具有标记功能用于超分辨成像的亚硝基笼化罗丹明衍生物，其特征在于，该衍生物具有如下结构通式：其中，x＝O、C(CH3)2或者Si(CH3)2；R1各自独立的为
--
C
n
H
2n+1
、
--
C
n
H
2n
COOH、
--
C
n
H
2n
SO3H或与同侧N原子、R2和苯环上碳原子构成的六元环状结构；R2各自独立的为H或CH3；R3为为其中：X-为阴离子，所述阴离子为BF
4-、Cl-、Br-、I-、NO
3-、SO
42-、ClO
4-、CH3COO-、CH3SO
3-或CF3SO
3-，所带正电荷总数等于阴离子X-所带负电荷总数；R4为
--
C
n
H
2n+1
或与同侧N原子及苯环上碳原子构成的六元环状结构；其中：n各自独立的为0-18的整数，m各自独立的为0-18的整数；R5各自独立的为各自独立的...
【专利技术属性】
技术研发人员：肖义，郑莹，叶智伟，张新富，陈令成，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：
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