一种治疗维罗非尼耐药的黑色素瘤的联合用药物及其应用制造技术

为了解决目前临床上出现的维罗非尼耐药问题，本发明专利技术提供了一种治疗维罗非尼耐药的联合用药。本发明专利技术联合使用BRAF抑制剂和BMX抑制剂可有效抑制耐维罗非尼的黑色素瘤细胞的增殖，其效果明显优于BRAF抑制剂或BMX抑制剂单独使用，可以作为新的克服维罗非尼耐药的治疗方法。

A combined drug for the treatment of verofinib resistant melanoma and its application

In order to solve the problem of drug resistance of vorofinib in clinic, the invention provides a combined drug for treating drug resistance of vorofinib. The combined use of BRAF inhibitor and BMX inhibitor can effectively inhibit the proliferation of melanoma cells resistant to vilofinib, and the effect is obviously better than that of BRAF inhibitor or BMX inhibitor alone, which can be used as a new treatment method to overcome the drug resistance of vilofinib.

【技术实现步骤摘要】
一种治疗维罗非尼耐药的黑色素瘤的联合用药物及其应用
本专利技术涉及生物医药
，尤其是BMX抑制剂在逆转维罗非尼耐药中的应用。
技术介绍
维罗非尼（Vemurafenib，PLX4032）是一种强效选择性BRAF(V600E)抑制剂，它选择性地与BRAFV600E激酶的ATP活性位点结合，抑制其活性，阻断有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路，抑制致癌基因活性，从而遏制肿瘤增殖。2017年3月，中国食品药品监督管理局批准维罗非尼在中国上市，用于治疗BRAFV600E突变的黑色素瘤患者。国内黑素瘤治疗指南（2018版）中注明维罗非尼是治疗晚期BRAFV600E突变黑色素瘤的一线标准治疗方案。与传统治疗黑色素瘤药物达卡巴嗪维相比，维罗非尼可以口服用药，起效时间缩短，无进展生存时间（PFS）延长半年，显著提高了BRAFV600突变黑色素瘤患者生存率。但在临床用药中其内在和获得性耐药限制了维罗非尼的应用，文献报道黑色素瘤患者在接受维罗非尼治疗6-8个月后往往对其产生耐药，严重影响了黑色素瘤患者的预后。临床上尝试MEK抑制剂与维罗非尼联用克服维罗非尼耐药，但效果不理想，寻找新的药物联用组合对于治疗维罗非尼耐药的肿瘤具有积极意义。BMX属于Tec激酶家族的非受体酪氨酸激酶，近几年作为抗肿瘤靶点引起人们的广泛关注。CHMFL-BMX-078是一种高效的，选择性的，不可逆的，II型BMX激酶抑制剂。目前该抑制剂抗肿瘤作用报道较少，对黑素瘤的影响至今未见文献报道。
技术实现思路
为了解决目前临床上出现的维罗非尼耐药问题，本专利技术提供了一种治疗维罗非尼耐药的联合用药。本专利技术的技术方案是：本专利技术提供了一种治疗维罗非尼耐药的黑色素瘤的联合用药，所述联合用药为BRAF抑制剂维罗非尼与BMX抑制剂联用。优选的，现有技术中所述BMX抑制剂共有两种，经过试验对比和验证，所述BMX抑制剂CHMFL-BMX-078对维罗非尼耐药细胞株具有明显的作用。优选的，所述联合用药中BMX抑制剂与维罗非尼的摩尔用量比为：维罗非尼：BMX抑制剂=（8-12）:1。优选的，所述联合用药中BMX抑制剂与维罗非尼的摩尔用量比为：维罗非尼：BMX抑制剂=10:1。本专利技术还提供了BRAF抑制剂维罗非尼与BMX抑制剂联用在制备治疗维罗非尼耐药的黑色素瘤药物中的应用。优选的，所述BMX抑制剂为CHMFL-BMX-078，其细胞用量是0.05-20μM，后期选择抑制率大约30%的作用浓度0.5μM作为两者联用的作用浓度；所述BRAF抑制剂为维罗非尼，其细胞用量是0.1-10μM，后期选择两者联用的作用浓度为5μM。与现有技术相比，本专利技术的优势是：本专利技术还提供了一种治疗黑色素瘤耐药的药物组合物，它是以BMX抑制剂和BRAF抑制剂联合使用，逆转维罗非尼耐药。本专利技术联合使用BMX抑制剂和BRAF抑制剂可有效逆转维罗非尼耐药的黑色素瘤细胞增殖，其抑制效果明显优于BMX抑制剂或BRAF抑制剂单独使用。本专利技术为治疗耐维罗非尼的黑色素瘤提供了新的工具，可以采用联合用药的方式，协同抑制黑色素瘤耐药株的生长，应用范围广泛，前景良好。以下结合附图和具体实施方式对本专利技术的详细结构作进一步描述。附图说明图1BMX抑制剂体外抑制耐维罗非尼黑色素瘤细胞增殖a，CCK8检测细胞数量；黑色素瘤耐维罗非尼细胞株A375-R分别用相应浓度的BMX抑制剂CHMFL-BMX-078处理72h，CCK-8检测细胞存活率。*p＜0.05；**p＜0.01。b，克隆形成实验；800个/孔黑色素瘤耐药株A375-R用相应浓度的BMX抑制剂CHMFL-BMX-078处理，每两天换液一次，7天后，经多聚甲醛固定，结晶紫染色，观察克隆形成情况。c，EDU检测细胞增殖；黑色素瘤耐药株A375-R分别经相应浓度的BMX抑制剂CHMFL-BMX-078处理，EDU检测细胞的增殖。图2与黑素瘤细胞亲本株相比，维罗非尼耐药株对BMX抑制剂对更敏感黑色素瘤亲本株A375、维罗非尼耐药株A375-R分别用相应浓度的BMX抑制剂CHMFL-BMX-078处理72h，CCK-8检测细胞存活率。*p＜0.05；**p＜0.01。图3与表皮细胞相比，BMX抑制剂对维罗非尼耐药株毒性更强黑色素瘤耐药株A375-R、表皮细胞Hacat分别用相应浓度的BMX抑制剂CHMFL-BMX-078处理72h，CCK-8检测细胞存活率。*p＜0.05；**p＜0.01。图4维罗非尼和BMX抑制剂联合使用显著抑制维罗非尼耐药株细胞增殖a，CCK8检测细胞数量；黑色素瘤耐药株A375-R分别经BMX抑制剂CHMFL-BMX-078、维罗非尼（Vemurafenib）、BMX抑制剂CHMFL-BMX-078+维罗非尼（Vemurafenib）处理，72h后，CCK-8检测细胞存活率。*p＜0.05；**p＜0.01。b，EDU检测细胞增殖；黑色素瘤耐药株A375-R分别经BMX抑制剂CHMFL-BMX-078、维罗非尼（Vemurafenib）、BMX抑制剂CHMFL-BMX-078+维罗非尼（Vemurafenib）处理，EDU检测细胞的增殖。c，克隆形成实验检测细胞增殖；黑色素瘤耐药株A375-R分别用相应浓度BMX抑制剂CHMFL-BMX-078、维罗非尼（Vemurafenib）、BMX抑制剂CHMFL-BMX-078+维罗非尼（Vemurafenib）处理，每两天换液一次，7天后，多聚甲醛固定，结晶紫染色，观察克隆形成情况。d，维罗非尼和BMX抑制剂联合使用抑制p-ERK的表达；黑色素瘤耐药株A375-R分别用维罗非尼、BMX抑制剂，两者联用处理48h，Westernblot检测ERK和p-ERK的蛋白表达水平，β-actin作为内参。图5维罗非尼与BMX抑制剂联用的协同效果优于与ACK1抑制剂联用黑色素瘤耐药株A375-R分别用0.5μMBMX抑制剂CHMFL-BMX-078，4μMACK1抑制剂AIM-100与相应浓度维罗非尼（Vemurafenib）联合作用72h，CCK-8检测细胞存活率。*/#p＜0.05；**/##p＜0.01。采用CompuSyn软件分析联合治疗的协同作用，联合指数(CI)=1表示加性效应，CI<1表示增效，CI>1表示拮抗。说明：附图中，VEM代表维罗非尼；CHMFL代表BMX抑制剂CHMFL-BMX-078；*/#表示显著差异(p＜0.05)；**/##表示极显著差异(p＜0.01)；***/###表示非常显著的差异(p＜0.001)。具体实施方式实验例1BMX抑制剂在体外抑制维罗非尼耐药细胞增殖。维罗非尼耐药株：A375-维罗非尼耐药株（A375-R）；BMX抑制剂：CHMFL-BMX-078。1.实验方法1.1实验处理：使用溶媒剂（DMSO）、BMX抑制剂（CHMFL-BMX-078）处理维罗非尼耐药细胞株。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种治疗维罗非尼耐药的黑色素瘤的联合用药物，其特征在于：所述联合用药为BRAF抑制剂维罗非尼与BMX抑制剂联用。/n

【技术特征摘要】
1.一种治疗维罗非尼耐药的黑色素瘤的联合用药物，其特征在于：所述联合用药为BRAF抑制剂维罗非尼与BMX抑制剂联用。


2.根据权利要求1所述治疗维罗非尼耐药的黑色素瘤的联合用药物，其特征在于：所述BMX抑制剂为CHMFL-BMX-078。


3.根据权利要求1所述治疗维罗非尼耐药的黑色素瘤的联合用药物，其特征在于：所述联合用药中BMX抑制剂与维罗非尼的摩尔用量比为：BMX抑制剂:维罗非尼=1:（8-12）。


4.根据权利要求4所述治疗维罗非尼耐药的黑色素瘤的联合用药物，其特征在于：所述联合用药中BMX抑制剂与...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘昭前，姜世龙，程岩，刘俊彦，
申请(专利权)人：中南大学湘雅医院，
类型：发明
国别省市：湖南;43