一种中性突变体搭桥的植物自发突变基因的快速定位和克隆方法技术

本发明专利技术属于植物基因工程技术领域。具体涉及一种中性突变体搭桥的植物自发突变基因的快速定位和克隆方法。本发明专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，利用EMS诱变剂组合物诱变产生的中性突变体来快速定位自发突变体基因。在同一遗传背景下，利用EMS诱变剂组合物诱变产生的中性突变体(即，没有肉眼可见的表型变异)与自发突变体杂交得到F

Rapid mapping and cloning of plant spontaneous mutation genes bridged by neutral mutants

【技术实现步骤摘要】
一种中性突变体搭桥的植物自发突变基因的快速定位和克隆方法
本专利技术属于植物基因工程
具体涉及一种中性突变体搭桥的植物自发突变基因的快速定位和克隆方法。即利用EMS诱变产生的中性突变体来快速定位自发突变体基因的方法。
技术介绍
自发突变(spontaneousmutation)是指在没有经过人为干扰的情况下，生物体自然发生的突变。这种突变主要来源于生物体DNA在复制过程中出现的碱基错配，自发病变或者转座子转座(Griffiths等.Anintroductiontogeneticanalysis.Macmillan,2005)。生物体由于自发突变产生的突变体称为自发突变体，这种突变体不仅包括生物体正常繁殖过程中产生突变体，也包括生物体在组织培养过程中产生的突变体。自发突变体的基因定位目前只能通过图位克隆(Map-basedcloning)的方法，即将自发突变体和另一个遗传背景不一样的亲本杂交，得到F2分离群体后，利用两亲本之间的核酸差异(分子标记)来进行基因定位。这种通过两亲本杂交产生F2分离群体的基因定位方法适用于造成植物发育和生长特征严重变异的主效突变基因的定位，例如水稻少分蘖突变体基因MOC1和半矮秆基因SD1(Li等.Controloftilleringinrice.Nature,2003,422:618-621；Monna等.Positionalcloningofricesemidwarfinggene,sd-1:rice“greenrevolutiongene”encodesamutantenzymeinvolvedingibberellinsynthesis.DNAresearch,2002,9:11-17)以及番茄成熟抑制基因Rin(Vrebalov等.AMADS-boxgenenecessaryforfruitripeningatthetomatoripening-inhibitor(rin)locus.Science,2002,296:343-346)的定位与克隆。但是这种方法不适用于造成数量性状变异的微效突变基因定位，这是因为在来源于两个遗传背景不同的亲本产生的F2群体中，有多个其它控制突变表型的基因存在分离，将会掩盖了微效突变基因的效应。这种掩盖效应将会导致表型与基因型不共分离，进而无法定位目标基因。对于自发突变的微效基因定位，目前只能通过把自发突变体与另一个亲本杂交，并通过回交的方式使背景纯合，使得群体只存在野生型和突变型两种表型，从而进行基因定位：例如水稻叶型基因NAL7的定位就是通过回交的方法(Fujino等.NARROWLEAF7controlsleafshapemediatedbyauxininrice.MolGenetGenomics,2008,279:499-507)。但是通过回交群体进行基因定位的方法有以下不足之处：一是由于不清楚目标基因所在的物理位置，导致在回交过程中选择供体单株具有盲目性，稍有不慎就可能在回交过程回交掉了目的基因片段，使突变基因定位存在较大风险；二是即使每世代回交单株携带突变基因，为了使该基因效应不受其它基因影响，就必须保证回交后代背景纯合度更高，则需要更多的回交世代。以上两个因素大大增加了自发突变基因定位的时间、人力和物力成本。基因定位以分子标记为基础，通过表型与分子标记的连锁关系寻找目标位点。分子标记不仅仅包括传统的RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism，限制性内切酶片段长度多态性)、RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA，随机扩增多态性DNA)或者SSR(SimpleSequenceRepeats，简单重复序列)标记，还包括测序产生的SNP(SingleNucleotidePolymorphism，单核苷酸多态性)及InDel(InsertionandDeletion，插入与缺失)标记。利用化学诱变剂EMS(EthylMethanesulfonate，甲基磺酸乙酯)诱变会产生丰富的SNP变异，它的主要原理是诱变碱基发生烷化反应，从而导致碱基在复制过程中发生错配反应。例如，EMS诱变中99％的烷基化发生在G(Guanine，鸟嘌呤)的O6位置上，使之变成O6-乙基鸟嘌呤，导致本来和G互补配对的C(cytosine，胞嘧啶)变成了T(Thymine，胸腺嘧啶)。在随后的DNA复制过程中，原来的G/C碱基对变成了A/T(AshburnerM.Drosophila.Alaboratoryhandbook.Coldspringharborlaboratorypress,1989；Greene等.Spectrumofchemicallyinducedmutationsfromalarge-scalereverse-geneticscreeninArabidopsis.Genetics,2003,164:731-740)；但是也有很少一部分烷基化发生在其它位置，例如G突变成7-乙基鸟嘌呤将会导致G/C到C/G或G/C到T/A的突变，而A由于烷基化形成的3-乙基腺嘌呤导致A/T到G/C的突变(KriegDR.Ethylmethanesulfonate-inducedreversionofbacteriophageT4rIImutants.Genetics,1963,48:561)。EMS诱变近年来被广泛用于突变体的人工诱导及基因定位，例如TILLING(Till等.Large-scalediscoveryofinducedpointmutationswithhigh-throughputTILLING.GenomeRes,2003,13:524-530)和MutMap技术(Abe等.GenomesequencingrevealsagronomicallyimportantlociinriceusingMutMap.NatBiotechnol,2012,30:174-178)均建立在EMS诱变的基础上。随着第二代测序技术的发展，通过测序的方式进行基因定位已经变得越来越成熟，例如MutMap方法(见上文)和QTL-seq方法(Takagi等.QTL-seq:rapidmappingofquantitativetraitlociinricebywholegenomeresequencingofDNAfromtwobulkedpopulations.PlantJ,2013,74:174-183)。以测序方式鉴定SNP和InDel信息并用于基因定位，大大节约了时间和人力成本，是未来基因定位的主要方向。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，利用EMS诱变产生的中性突变体来快速定位自发突变体基因。在同一遗传背景下，利用EMS诱变剂组合物产生的中性突变体(和野生型相比没有表型变异)和自发突变体杂交得到F1，再自交得到F2代。通过筛选F2群体中极端隐性表型单株混合测序，结合EMS诱变的中性突变体测序数据，借助于生物信息学方法快速定位突变基因。本专利技术要解决的技术问题是：目前对于本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种植物自发突变基因的快速定位和克隆方法，其特征在于：利用甲基磺酸乙酯(EMS)诱变剂组合物处理植物，使其产生覆盖全基因组的核苷酸变异，得到没有表型差异的中性突变体；利用所述的中性突变体与自发突变体杂交产生F

【技术特征摘要】
1.一种植物自发突变基因的快速定位和克隆方法，其特征在于：利用甲基磺酸乙酯(EMS)诱变剂组合物处理植物，使其产生覆盖全基因组的核苷酸变异，得到没有表型差异的中性突变体；利用所述的中性突变体与自发突变体杂交产生F2群体，用于突变基因的快速定位。


2.根据权利要求1所述的一种植物自发突变基因的快速定位和克隆方法，其特征在于：所述的具体步骤包括：
(1)根据自发突变体的遗传背景选择同一遗传背景的品种X作为诱变材料，经EMS组合物诱变后，至少自交3代以上，排除有害突变后观察表型，选择表型与品种X没有差异的诱变单株，作为中性突变体EMS-X；
(2)将所得的中性突变体EMS-X和自发突变体杂交得到F1代，自交后种植F2代群体；
(3)调查步骤(2)的F2代群体表型，统计分离比，若性状分离比符合单基因分离比即可进行基因定位，分别对EMS-X和F2群体中极端隐性表型混合池进行测序；
(4)分析提取EMS-X和极端隐性单株混合池测序的SNP/InDel，然后筛选候选目标位点；
(5)通过提取的SNP/InDel计算S...

【专利技术属性】
技术研发人员：邢永忠，胡伟，周天浩，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42