一种快速检测硫丹的胶体金免疫层析试纸条及其制备和检测方法技术

本发明专利技术提供一种快速检测硫丹的胶体金免疫层析试纸条及其制备和检测方法，包括半抗原的制备：通过琥珀酸酐法对与硫丹具有相似结构的硫丹醇进行衍生化，引入羧基，制备得到硫丹半抗原；完全抗原的制备：将所述硫丹半抗原通过活化酯法偶联蛋白质分别制备免疫原和包被原；单克隆抗体的制备：用所述免疫原免疫小鼠制备硫丹单克隆抗体；胶体金免疫层析试纸的制备：将所述二抗涂在硝酸纤维素膜上作为质控线，将所述包被原喷涂在硝酸纤维素膜作为检测线。本发明专利技术适宜现场大量样本快速筛选，灵敏度高、检测速度快、成本低和无需仪器辅助，可实现对硫丹的现场检测，该方法适用于食品安全检测领域。

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测硫丹的胶体金免疫层析试纸条及其制备和检测方法
本专利技术属于食品安全检测
，尤其涉及一种快速检测硫丹的胶体金免疫层析试纸条及其制备和检测方法。
技术介绍
硫丹又称赛丹、硕丹和安杀丹，其化学名称是1,2,3,4,7,7-六氯双环(2,2,1)-庚烯-(2)双羟甲基-5,6-亚硫酸酯，分子式为C9H6Cl6O3S，主要由两种同分异构体(α-硫丹和β-硫丹)的混合物的形式存在。硫丹是于1945年研发合成的一种环戊二基类的机氯农药，由于其杀虫效果好且持效性强而广泛应用于水果、蔬菜和茶叶等农作物的害虫防治，通过与氯离子通道结合，阻碍氯离子的内流而导致神经毒性作用使虫体死亡。硫丹是一种典型的持久性有机污染物(POPs)，国家癌症机构通过动物实验证实了POPs是诱发癌症的重要原因之一。另外，硫丹在环境中具有高生物毒性、持久性和远距离迁移等特点，可以在水源、食物链和人体组织中长期地累积，其潜在的致癌性能够对人体造成持续性的危害，因此引起了国内外广泛的关注。2011年，硫丹被列入《斯德哥尔摩公约》中的禁用物质列表当中，2019年3月26日，我国全面禁止硫丹在农业中的应用，食品中农药最大残留限量中规定硫丹在蔬菜和水果类残留限量为0.05mg/kg。目前，针对硫丹的检测方法主要依靠传统的仪器分析方法，主要包括高效液相色谱(HPLC)、气相色谱-串联质谱联用(GC-MS)和液相色谱-串联质谱联用(LC-MS)。上述分析方法的检测速度慢，需要昂贵的仪器和专业的操作人员，且受样本前处理的影响较大，其应用范围受到一定的限制，无法满足现场大量样本的快速检测。免疫学检测方法是基于抗原抗体的特异性反应，并通过显色进行检测的一种方法。目前国内已授权或公告的关于硫丹的免疫分析检测方法仅有两篇。快速检测硫丹、DDT残留的胶体金试纸(授权公告号：CN2844924Y)中的硫丹的胶体金试纸的最低检出限量为0.5～1mg/kg，无法满足国家的限量标准。有机氯农药硫丹人工抗原和抗体及其制备方法与应用(公开号：CN1700001A)中建立的ELISA方法，实验操作步骤繁琐和耗时长，检测结果需借助仪器辅助，不适宜现场快速检测。
技术实现思路
针对上述存在的问题，本专利技术提供一种快速检测硫丹的胶体金免疫层析试纸条及其制备和检测方法，通过制备高质量的硫丹单克隆抗体，而后在基于单克隆抗体之上建立检测速度快、成本低、灵敏度高的胶体金免疫层析试纸条，所述试纸条仅特异性的检测硫丹，检测速度快、成本低、无需仪器辅助，适宜现场大量样本的快速检测和筛选。一种快速检测硫丹的胶体金免疫层析试纸条制备方法，包括以下步骤：半抗原的制备：通过琥珀酸酐法对与硫丹具有相似结构的硫丹醇进行衍生化，引入羧基，制备得到硫丹半抗原；完全抗原的制备：将所述硫丹半抗原通过活化酯法偶联蛋白质分别制备免疫原和包被原；单克隆抗体的制备：用所述免疫原制备单克隆抗体，用所述包被原通过ic-ELISA检测筛选，进行细胞融合，得到硫丹单克隆抗体；胶体金免疫层析试纸的制备：将所述二抗涂在硝酸纤维素膜上作为质控线，将所述包被原喷涂在硝酸纤维素膜作为检测线，再按照试纸条的结构进行组装。上述方案中，所述半抗原的制备方法具体为：将硫丹醇充分溶解于吡啶，加入丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶，旋转蒸发，加入纯水溶解沉淀物，加入NaOH溶液将pH调至9～10，用正己烷萃取，收集所有的水相，用HCl溶液将水相溶液pH调至3～4，有固体析出，过滤和烘干后得到的产物即为硫丹半抗原。进一步的，所述HCl溶液和NaOH溶液的浓度为1M。进一步的，所述硫丹醇、吡啶、丁二酸酐、4-二甲氨基吡啶的用量比为20～50mg:1～3mL：8～20mg：1～3mg。上述方案中，所述完全抗原的制备是将所述半抗原通过活化酯法偶联牛血清白蛋白制备免疫原，将半抗原通过活化酯法偶联鸡卵白蛋白制备包被原，具体为：将硫丹半抗原溶解于二甲基甲酰胺中，加入N-羟基琥珀酰亚胺NHS和1-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC，室温反应进行活化，得到已经活化的硫丹半抗原；将牛血清白蛋白BSA和鸡卵清白蛋白OVA分别溶解于碳酸盐缓冲液CBS中，将所述已经活化的硫丹半抗原逐滴加到牛血清白蛋白BSA和鸡卵清白蛋白OVA溶液中，室温反应，用磷酸盐缓冲PBS透析，分别得到免疫原和包被原。进一步的，在所述硫丹半抗原的活化过程中，所述硫丹半抗原、N-羟基琥珀酰亚胺NHS和1-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC的用量摩尔比为1：2～3：2～3。进一步的，在所述免疫原和包被原的制备过程中，所述牛血清白蛋白BSA、鸡卵清白蛋白OVA和硫丹半抗原的用量摩尔比为30～50：30～50：1。上述方案中，所述胶体金免疫层析试纸条的制备具体包括以下步骤：所述胶体金免疫层析试纸条包括样品垫、硝酸纤维素(NC)膜、吸水垫和底板，将硝酸纤维素膜贴在底板的中间，吸水垫和样品垫分别贴在底板的上下两边，将所述二抗涂在硝酸纤维素膜上作为质控线，将所述包被原喷涂在硝酸纤维素膜作为检测线，制备得到胶体金免疫层析试纸条。一种快速检测硫丹的胶体金免疫层析试纸条，根据所述检测硫丹的胶体金免疫层析试纸条制备方法制备。一种根据所述快速检测硫丹的胶体金免疫层析试纸条的检测方法，将所述单克隆抗体标记胶体金得到金标抗体，将待测硫丹样本提取液与所述金标抗体孵育5min，插入所述胶体金免疫层析试纸条，3min后进行判读检测结果。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：1.本专利技术选择既具有硫丹的核心结构，又有和硫丹结构相似的硫丹醇为半抗原，对其进行衍生化，偶联载体蛋白制备免疫原和包被原；将制备的免疫原免疫小鼠制备灵敏度高和特异性强的单克隆抗体。而后在基于单克隆抗体之上建立检测速度快、检测成本低、灵敏度高且仅特异性地识别硫丹的胶体金免疫层析试纸条。本专利技术制备的胶体金免疫层析试纸条特异性较强，检测速度快、无需仪器辅助、成本低、适宜现场硫丹的快速检测。2.本专利技术制备的胶体金免疫层析试纸仅特异性的识别硫丹，硫丹具有高生物毒性和蓄积性，因此对硫丹的检测具有非常大的价值和意义。3.本专利技术将胶体金标记单克隆抗体制备的试纸条,灵敏度高，检测结果可直接视觉判读，检测成本低，检测速度快，直接将样本提取液与金标抗体孵育5min，插入试纸条，3min后即可判读检测结果，适宜大量样本的快速检测。4.本专利技术制备的胶体金免疫层析试纸条，检测步骤简单，无需专业的操作人员；检测无需仪器的辅助，可随时随地进行检测，可满足执法部门、养殖户、消费者等人群的需求，该方法适用性强，便于推广使用，具有广阔的市场前景和社会效益。附图说明图1为本专利技术一实施方式的胶体金免疫层析试纸条的结构示意图。图2为本专利技术一实施方式的胶体金表征图：(A)为紫外图；(B)为胶体金的透射电镜图(TEM)。图3为本专利技术一实施方式的胶体金免疫层析试纸条检测硫丹残留的实际效果图。具体实施方式下面结合附图对本专利技术的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速检测硫丹的胶体金免疫层析试纸条制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n半抗原的制备：通过琥珀酸酐法对与硫丹具有相似结构的硫丹醇进行衍生化，引入羧基，制备得到硫丹半抗原；/n完全抗原的制备：将所述硫丹半抗原通过活化酯法偶联蛋白质分别制备免疫原和包被原；/n单克隆抗体的制备：用所述免疫原免疫小鼠，通过ic-ELISA法检测筛选，进行细胞融合，得到硫丹单克隆抗体；/n胶体金免疫层析试纸的制备：将所述二抗涂在硝酸纤维素膜上作为质控线，将所述包被原喷涂在硝酸纤维素膜作为检测线，再按照试纸条的结构进行组装。/n

【技术特征摘要】
1.一种快速检测硫丹的胶体金免疫层析试纸条制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
半抗原的制备：通过琥珀酸酐法对与硫丹具有相似结构的硫丹醇进行衍生化，引入羧基，制备得到硫丹半抗原；
完全抗原的制备：将所述硫丹半抗原通过活化酯法偶联蛋白质分别制备免疫原和包被原；
单克隆抗体的制备：用所述免疫原免疫小鼠，通过ic-ELISA法检测筛选，进行细胞融合，得到硫丹单克隆抗体；
胶体金免疫层析试纸的制备：将所述二抗涂在硝酸纤维素膜上作为质控线，将所述包被原喷涂在硝酸纤维素膜作为检测线，再按照试纸条的结构进行组装。


2.根据权利要求1所述的快速检测硫丹的胶体金免疫层析试纸条制备方法，其特征在于，所述半抗原的制备方法具体为：
将硫丹醇充分溶解于吡啶，加入丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶，旋转蒸发，加入纯水溶解沉淀物，加入NaOH溶液将pH调至9～10，用正己烷萃取，收集所有的水相，用HCl溶液将水相溶液pH调至3～4，有固体析出，过滤和烘干后得到的产物即为硫丹半抗原。


3.根据权利要求2所述的快速检测硫丹的胶体金免疫层析试纸条制备方法，其特征在于，所述HCl溶液和NaOH溶液的浓度为1M。


4.根据权利要求2所述的快速检测硫丹的胶体金免疫层析试纸条制备方法，其特征在于，所述硫丹醇、吡啶、丁二酸酐、4-二甲氨基吡啶的用量比为20～50mg：1～3mL：8～20mg：1～3mg。


5.根据权利要求1所述的快速检测硫丹的胶体金免疫层析试纸条制备方法，其特征在于，所述完全抗原的制备是将所述半抗原通过活化酯法偶联牛血清白蛋白制备免疫原，将半抗原通过活化酯法偶联鸡卵白蛋白制备包被原，具体为：
将硫丹半抗原溶解于二甲基甲酰胺中，加入N-羟基琥珀酰亚胺NHS和1-乙...

【专利技术属性】
技术研发人员：周兴华，张彩芹，赵延胜，肖香，王云，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32