一种不同环境污染物造成DNA损伤的化学发光体外评价方法技术

本发明专利技术提供了一种不同环境污染物造成DNA损伤的化学发光体外评价方法，该技术方案以磁性微球作为载体，将富含G碱基的DNA作为固定相固定于磁性微球表面。采用Fenton试剂在反应中产生的具有强氧化能力的·OH将G碱基氧化为8‑OHdG，再利用抗体的特异识别，就可以检测DNA上受到氧化损伤产生的8‑OHdG量，从而建立8‑OHdG与磁性微球上结合的抗体量的关系。利用抗体上修饰有HRP能产生化学发光信号，建立DNA上受到氧化损伤产生的8‑OHdG与化学发光强度的对应关系，从而得到氧化产生的8‑OHdG量与化学发光强度的量化关系，间接实现8‑OHdG的定量分析检测，而且大大提高了检测灵敏度和精密度。

【技术实现步骤摘要】
一种不同环境污染物造成DNA损伤的化学发光体外评价方法
本专利技术涉及分析化学
，进一步涉及核酸适配体技术，具体涉及一种不同环境污染物造成DNA损伤的化学发光体外评价方法。
技术介绍
DNA氧化损伤与衰老、疾病、癌症以及环境当中所存在的有害物质有着毋庸置疑的联系，8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2’deoxyguanosine，8-OHdG)是DNA氧化损伤产生的加合物，由于8-OHdG在人体中不能进一步代谢，从而会分散在血液和尿液中。因此8-OHdG也就成为预防疾病，提前预防癌症发生的主要标志物。因此研究8-OHdG检测新方法越来越受到重视，研究一种满足不同层次的快速灵敏性高并且简便的检测方法具有重要意义。8-OHdG通过血液运输并排泄到尿液中而不会进一步代谢。因此，可以通过检测尿液中8-OHdG的浓度判断DNA的氧化损伤浓度。目前，32P后标记法是应用最广泛，灵敏度最高的8-OHdG检测方法，但32P在实验过程中会对实验人员本身形成放射性损害，且如果实验废液处理不当，还会造成环境污染。所以该法不适宜推广。另外，常见的8-OHdG检测方法还有高效液相色谱-电化学检测法、高效毛细管电泳法、气相-质谱联用法、同位素稀释质谱法等，但这些方法存在成本高、处理复杂、只能实现微量制备等问题导致无法满足大批量样本快速筛查的需要。因此，开发用于检测痕量8-OHdG的高灵敏度，方便且成本有效的传感器是必要的。利用抗原与抗体特异性结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性的方法已成为分析化学领域中的常见方法，这里使用了环境污染物氧化了固定在磁性微球上DNA单链上的G碱基产生抗原8-OHdG，加入8-OHdG抗体与8-OHdG特异性结合而联接在磁性微球载体上，用磁性洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，继续加入HRP标记的二抗与8-OHdG抗体特异性结合，使得在磁性微球载体上的HRP量与受检物质8-OHdG的量成一定的比例。该方法在大多数实验室中易于执行，特异性好，重现性佳，灵敏度高。
技术实现思路
针对现有技术中的不足与难题，本专利技术旨在提供一种不同环境污染物造成DNA损伤的化学发光体外评价的制备方法及其应用，用于解决现有技术中8-OHdG适体传感器检测方法灵敏性差、结果不稳定，制备效率低、应用效果不佳的技术缺陷。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种不同环境污染物造成DNA损伤的化学发光体外评价方法，包括以下步骤：1)通过羧氨反应将氨基封端并富含G碱基的DNA报告序列固定于羧基磁性微球表面，得到磁性微球-富含G碱基的DNA报告序列复合物；2)向步骤1)加入Fe2+/H2O2试剂，使得Fenton反应氧化DNA上的G碱基得到8-OHdG；3)向步骤2)加入过量的Goatanti-8-OHdG，使抗体捕捉DNA报告序列上被氧化损伤产生的8-OHdG；4)将步骤3)加入过量的HRP标记的Rat-anti-goatIgG，使HRP标记的Rat-anti-goatIgG充分识别Goatanti-8-OHdG并固定在磁性微球上，反应后取固相，即得到8-OHdG适体传感器；5)向步骤4)所述8-OHdG适体传感器HRP化学发光底物混匀，而后检测发光信号CL值。作为优选，步骤1)包括以下操作：取磁性微球，利用0.05～0.2M的咪唑缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于含有EDC的咪唑缓冲溶液中，于35～39℃震荡孵育15～25min，而后以磁性微球与氨基封端的DNA报告序列用量比为3:1～2(μL:pmoL)的比例加入氨基封端的DNA报告序列，于35～39℃震荡反应50～70min。作为优选，步骤1)还包括以下操作：于35～39℃震荡反应50～70min后，取固相后用PBST缓冲溶液洗涤。在该优选技术方案中，利用PBST缓冲溶液洗涤，旨在去除未连接至磁性微球表面的报告序列，洗涤次数可以优选为3次。作为优选，步骤1)还包括以下操作：利用PBST缓冲溶液洗涤后，取固相加入8～12％的BSA溶液，于35～39℃条件下震荡50～70min，得磁性微球-富含G碱基的DNA报告序列复合物。利用BSA缓冲溶液洗涤，旨在以封闭磁性微球表面多余结合位点，洗涤次数可以优选为3次。作为优选，步骤2)包括以下操作：磁性微球-富含G碱基的DNA报告序列复合物，加入1mL的0.5～1.5MFeCl2和1mL的1～3MH2O2并在35～39℃恒温震荡反应10-14h。其中FeCl2/H2O2溶液的PH为3。作为优选，步骤3)再加入100μL稀释倍数为1:1000的Goatanti-8-OHdG恒温震荡反应50～70min，使抗体捕捉DNA报告序列上被氧化损伤产生的8-OHdG，并固定在磁性微球表面。该步骤在恒温震荡1h，有利于Goatanti-8-OHdG充分捕捉DNA报告序列上被氧化损伤产生的8-OHdG。作为优选，步骤4)加入100μL稀释倍数为1:100000的HRP标记的Rat-anti-goatIgG在35～39℃下恒温震荡反应50～70min，使HRP标记的Rat-anti-goatIgG充分识别Goatanti-8-OHdG并固定在磁性微球上，用PBST洗涤磁性微球，即得到8-OHdG适体传感器。该步骤用PBST洗涤磁性微球优选次数为3次。作为优选，步骤5)8-OHdG适体传感器悬浮于50μLHRP化学发光底物A液中，再用移液枪将其转移至圆柱形玻璃测量皿中，用移液枪移取50μLHRP化学发光底物B液至玻璃测量皿中，待充分混合均匀后放入化学发光检测仪中，而后检测发光信号CL值。作为优选，以上技术方案中所述的取固相，均是通过磁性分离移去上清液实现的。作为优选，所述检测发光信号CL值，是利用BPCL微弱化学发光仪实现的。在以上技术方案中，所述咪唑缓冲液同样可选用常规配方。所述PBST缓冲溶液可以是含有137mMNaCl，2.7mMKCl，10mMNa2HPO4·12H2O，2mMKH2PO4，0.05％Tween20的水溶液，其pH是7.2～7.6。在以上技术方案中，氨基端的DNA报告序列：5′-AGAGAACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAGGGTTTTTTT-NH2-3′。该物质可自试剂销售公司定制、购得。在以上技术方案中，所述的Goatanti-8-OHdG，Rat-anti-goatIgG物质可自试剂销售公司定制、购得。所述过量的Goatanti-8-OHdG，，是指构建磁性微球-8OHdG适体传感器的反应中，前者量较多、使结合反应完成后仍存在未结合有Goatanti-8-OHdG的磁性微球-8-OHdG复合物游离于体系中的情形；具体的Goatanti-8-OHdG用量可根据对待测样品中8-OHdG的含量的估算来确定，当然亦可参照本专利技术实施例中Goatanti-8-OHdG用量来实施本专利技术。所述过量的Rat-anti-goatIgG，是指构建磁性微球-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种不同环境污染物造成DNA损伤的化学发光体外评价方法，其特征在于包括以下步骤：/n1)通过羧氨反应将氨基封端并富含G碱基的DNA报告序列固定于羧基磁性微球表面，得到磁性微球-富含G碱基的DNA报告序列复合物；/n2)向步骤1)加入Fe

【技术特征摘要】
1.一种不同环境污染物造成DNA损伤的化学发光体外评价方法，其特征在于包括以下步骤：
1)通过羧氨反应将氨基封端并富含G碱基的DNA报告序列固定于羧基磁性微球表面，得到磁性微球-富含G碱基的DNA报告序列复合物；
2)向步骤1)加入Fe2+/H2O2试剂，使得Fenton反应氧化DNA上的G碱基得到8-OHdG；
3)向步骤2)加入过量的Goatanti-8-OHdG，使抗体捕捉DNA报告序列上被氧化损伤产生的8-OHdG；
4)将步骤3)加入过量的HRP标记的Rat-anti-goatIgG，使HRP标记的Rat-anti-goatIgG充分识别Goatanti-8-OHdG并固定在磁性微球上，反应后取固相，即得到8-OHdG适体传感器；
5)向步骤4)所述8-OHdG适体传感器HRP化学发光底物混匀，而后检测发光信号CL值。


2.根据权利要求1所述的一种不同环境污染物造成DNA损伤的化学发光体外评价方法，其特征在于步骤1)包括以下操作：取磁性微球，利用0.05～0.2M的咪唑缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于含有EDC的咪唑缓冲溶液中，于35～39℃震荡孵育15～25min，而后以磁性微球与氨基封端的DNA报告序列用量比为3:1～2(μL:pmoL)的比例加入氨基封端的DNA报告序列，于35～39℃震荡反应50～70min。


3.根据权利要求2所述的一种不同环境污染物造成DNA损伤的化学发光体外评价方法，其特征在于步骤1)还包括以下操作：于35～39℃震荡反应50～70min后，取固相后用PBST缓冲溶液洗涤。


4.根据权利要求3所述的一种不同环境污染物造成DNA损伤的化学发光体外评价方法，其特征在于步骤1)还包括以下操作：利用PBST缓冲溶液洗涤后，取固相加入8～12％的BSA溶液，于35～39℃条件下震荡50～70mi...

【专利技术属性】
技术研发人员：严喜鸾，束庆磊，肖义陂，刘杰，赵坤，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：江西;36