一种基于胃蛋白酶原PGⅡ的免疫分析试剂盒及其制备方法和检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于胃蛋白酶原PGⅡ的免疫分析试剂盒及其制备方法和检测方法，属于免疫检测分析技术和纳米生物技术领域，在所述试剂盒中，包括集成在试剂条上的反应缓冲液、清洗液、增强液、包被PGⅡ抗体的磁微粒溶液、铕标记的PGⅡ抗体溶液，还有2瓶PGⅡ的冻干校准品。上述试剂盒可以提供一种接近均相的反应体系，检测PGⅡ的含量，缩短检测时间，提高了效率，为临床使用提供便利。

【技术实现步骤摘要】
一种基于胃蛋白酶原PGⅡ的免疫分析试剂盒及其制备方法和检测方法
本专利技术属于免疫检测分析技术和纳米生物
，具体涉及一种基于胃蛋白酶原Ⅱ时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其制备方法和检测方法。
技术介绍
胃蛋白酶原(pepsinogen，PG)是由胃部分泌的参与消化的胃蛋白酶的前体，通常约1％的PG可通过胃黏膜进入血液循环，可分为PGⅠ和PGⅡ两种生化和免疫活性等特征的不同亚群，且细胞来源及组织内分布各不相同。血清PG浓度主要反映胃腺细胞的分泌水平。PGⅠ是检测胃泌酸腺细胞功能的指征，胃酸分泌增多PGⅠ升高，反之则降低；PGⅡ与胃底黏膜病变的相关性较大，其升高与胃底腺管萎缩、胃上皮化生或假幽门腺化生、异型增值有关；PGⅠ/Ⅱ比值进行性降低与胃黏膜萎缩进展相关。联合测定PGⅠ、PGⅡ及PGⅠ/Ⅱ比值可起到胃底腺黏膜“血清学活检”的作用。在做胃镜前后测定PGⅠ和PGⅡ水平，并定期追踪，可有效监控胃黏膜状态和功能。时间分辨荧光免疫分析(time-resolvedfluoroimmunoassay，TRFIA)是一种以镧系元素螯合物为标记物的新兴技术，具有零本底、线性范围宽、稳定性好等特点，灵敏度可达到10-18mol/L，较ELISA、CLIA、ECLIA等的10-9～10-15mol/L更高，TRFIA的主要创新内容在于应用荧光强度大、衰变时间长、分子量小的镧系原子标记免疫分子，而不是常用的大分子的酶或放射性同位素，故建立的免疫方法灵敏度和量程成倍增加，而且没有放射性污染。时间分辨荧光免疫分析技术标记离子的荧光是类线光谱，其特点是激发光波长范围较宽而发射光谱峰范围较窄，这样有利于降低本底的荧光强度，提高检测的分辨率；在时间分辨荧光免疫分的激发光和发射光之间存在较大的Stokes位移，这有利于排除非特异荧光的干扰，从而增强了测量的特异性；标记离子螯合物产生的荧光强度高，寿命长，这有利于消除样品及环境中非特异荧光物质对检测结果的影响；每一次检测都要重复进行1000次，取平均的荧光计数值作为结果，从而提高了检测的准确性。TRFIA是国内外免疫分析的主要发展方向之一。
技术实现思路
针对现有技术中存在的缺陷，本专利技术的目的是将TRFIA与磁微粒技术相结合，将所有试剂集成在一个试剂条上，建立PGⅡ-TRFIA方法，该检测可由全自动设备操作，准确度高，单人份检测，使用方便，将此技术应用于胃部病变的研究，可以更准确的鉴别诊断浅表性胃炎、胃粘膜糜烂溃疡、萎缩性胃炎、慢性胃炎、慢性胃扩张、慢性十二指肠炎、十二指肠溃疡等胃部病变，以通过方便的血清学检查进行胃部病变的疗效评估。为胃部病变的诊断和治疗提供一个非常便捷的新手段。本专利技术解决技术问题所采用的技术方案是：一种基于胃蛋白酶原PGⅡ的免疫分析试剂盒，所述试剂盒内包括至少一个试剂架，每个所述的试剂架上包括至少五个试剂条，所述试剂盒内还包括至少二瓶PGⅡ的冻干校准品；所述试剂条上包括磁珠孔、反应缓冲液孔、铕标冻干孔、检测孔、清洗液孔、增强液孔和若干个预留孔；所述磁珠孔内填充包被PGⅡ抗体的磁微粒溶液，所述反应缓冲液孔内填充反应缓冲液，所述铕标冻干孔内填充铕标记的PGⅡ抗体溶液，所述检测孔内填充待检样品，所述清洗液孔内填充清洗液，所述增强液孔内填充增强液。进一步地，所述试剂盒内包括5～20个试剂架，每个所述的试剂架上设有5个试剂条；所述试剂盒内还包括2瓶PGⅡ的冻干校准品。进一步地，所述包被PGⅡ抗体的磁微粒溶液经直径为50～5000纳米的活化的磁微粒与PGⅡ抗体连接、洗涤、封闭制备得到；所述铕标记的PGⅡ抗体溶液以Eu3+-N2-[P-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸钠标记PGⅡ抗体制备得到，所述PGⅡ抗体与所述Eu3+-N2-[P-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸钠的质量比为5:1。进一步地，所述反应缓冲液为pH7.8的50mmol/LTris-HCl含8mmol/LNaCl、0.1％BSA、50μmol/LDTPA、0.1ml/LTween-80和0.1％NaN3；所述清洗液为含0.48g/L的Tris、12.49g/L的NaCl、1.11g/L的Tween-20，以盐酸调节pH为7.8的缓冲溶液；所述增强液为含体积浓度为3.6‰的冰醋酸、0.5g/L的醋酸钠、0.05g/L的β-萘甲酰三氟丙酮、0.03g/L的三辛基氧化膦和体积浓度为1‰的TritonX-100的混合溶液；所述PGⅡ的冻干校准品为用含2g/L的BSA和1g/L的NaN3的50mmol/L的pH7.8Tris-HCl的反应缓冲液，将PGⅡ配制成不同浓度的校准品溶液。一种基于胃蛋白酶原PGⅡ的免疫分析试剂盒的制备方法，所述制备方法包括以下内容：PGⅡ校准品溶液的制备：取高浓度的PGⅡ抗原溶液用含2g/L的BSA和1g/L的NaN3的50mmol/L的pH为7.8的Tris-HCl反应缓冲液配制成不同浓度的校准品溶液，进行分装，2～8℃保存；包被PGⅡ抗体的磁微粒溶液的制备：取直径为50～5000nm的四氧化三铁微球用质量浓度为0.5～2％的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)活化，室温混匀4小时后，用0.05mol/L的pH为5.0的MES缓冲液清洗1～3次，然后用上述缓冲溶液进行悬浮，制成浓度为100mg/mL的磁微粒悬浮液；取100μL所述磁微粒悬浮液，然后加入1mL的0.05mol/L的pH为5.0的MES缓冲液和50μg的PGⅡ抗体，于25℃混匀温育2小时，然后进行磁性分离，保留磁微粒，用pH为7.2的5％BSA和0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液清洗1～3次，用pH为7.2的5％BSA和0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液于25℃下封闭30分钟，用含有质量浓度为0.5％BSA和质量浓度为0.1％的NaN3的0.05mol/L的pH为7.2的Tris-HCl缓冲液清洗1～3次，用含有质量浓度为0.5％BSA和质量浓度为0.1％的NaN3的0.05mol/L的pH为7.2的Tris-HCl缓冲液重悬，分装，置于2～8℃下保存；铕标记的PGⅡ抗体溶液的制备：取PGⅡ抗体1mg，经PD-10转换缓冲条件，洗脱液为含0.155mol/LNaCl的50mmol/L的pH为8.5的Na2CO3-NaHCO3缓冲液，获得浓缩至2g/L的PGⅡ抗体溶液；取所述PGⅡ抗体溶液500μL加入0.2mg的异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕钠，25℃下振荡反应20小时，将反应液转移到预先用pH为7.8的浓度为80mmol/L的Tris缓冲液平衡的SephadexG-50柱上进行层析，收集蛋白峰，稀释，进行分装，真空冷冻干燥，置于2～8℃保存；增强液的制备：体积浓度为3.6‰的冰醋酸，0.5g/L的醋酸钠，0.05g/L的β-萘甲酰三氟丙酮，0.03g/L的三辛基氧化膦和体积浓度为1‰的TritonX-100的混合溶液。反应缓冲液为pH7.8的50mmol/LTris-HCl含8mmol/LNaCl、0.1％BSA、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于胃蛋白酶原PGⅡ的免疫分析试剂盒，其特征在于：所述试剂盒内包括至少一个试剂架，每个所述的试剂架上包括至少五个试剂条，所述试剂盒内还包括至少二瓶PGⅡ的冻干校准品；所述试剂条上包括磁珠孔、反应缓冲液孔、铕标冻干孔、检测孔、清洗液孔、增强液孔和若干个预留孔；所述磁珠孔内填充包被PGⅡ抗体的磁微粒溶液，所述反应缓冲液孔内填充反应缓冲液，所述铕标冻干孔内填充铕标记的PGⅡ抗体溶液，所述检测孔内填充待检样品，所述清洗液孔内填充清洗液，所述增强液孔内填充增强液。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于胃蛋白酶原PGⅡ的免疫分析试剂盒，其特征在于：所述试剂盒内包括至少一个试剂架，每个所述的试剂架上包括至少五个试剂条，所述试剂盒内还包括至少二瓶PGⅡ的冻干校准品；所述试剂条上包括磁珠孔、反应缓冲液孔、铕标冻干孔、检测孔、清洗液孔、增强液孔和若干个预留孔；所述磁珠孔内填充包被PGⅡ抗体的磁微粒溶液，所述反应缓冲液孔内填充反应缓冲液，所述铕标冻干孔内填充铕标记的PGⅡ抗体溶液，所述检测孔内填充待检样品，所述清洗液孔内填充清洗液，所述增强液孔内填充增强液。


2.如权利要求1所述的一种基于胃蛋白酶原PGⅡ的免疫分析试剂盒，其特征在于：所述试剂盒内包括5～20个试剂架，每个所述的试剂架上设有5个试剂条；所述试剂盒内还包括2瓶PGⅡ的冻干校准品。


3.如权利要求1所述的一种基于胃蛋白酶原PGⅡ的免疫分析试剂盒，其特征在于：所述包被PGⅡ抗体的磁微粒溶液经直径为50～5000纳米的活化的磁微粒与PGⅡ抗体连接、洗涤、封闭制备得到；
所述铕标记的PGⅡ抗体溶液以Eu3+-N2-[P-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸钠标记PGⅡ抗体制备得到。


4.如权利要求1所述的一种基于胃蛋白酶原PGⅡ的免疫分析试剂盒，其特征在于：所述反应缓冲液为pH7.8的50mmol/LTris-HCl含8mmol/LNaCl、0.1％BSA、50μmol/LDTPA、0.1ml/LTween-80和0.1％NaN3；
所述清洗液为含0.48g/L的Tris、12.49g/L的NaCl、1.11g/L的Tween-20，以盐酸调节pH为7.8的缓冲溶液；
所述增强液为含体积浓度为3.6‰的冰醋酸、0.5g/L的醋酸钠、0.05g/L的β-萘甲酰三氟丙酮、0.03g/L的三辛基氧化膦和体积浓度为1‰的TritonX-100的混合溶液；
所述PGⅡ的冻干校准品为用含2g/L的BSA和1g/L的NaN3的50mmol/L的pH7.8Tris-HCl的反应缓冲液，将PGⅡ配制成不同浓度的校准品溶液。


5.一种如权利要求1至4中任意一项所述的基于胃蛋白酶原PGⅡ的免疫分析试剂盒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下内容：
PGⅡ校准品溶液的制备：取高浓度的PGⅡ抗原溶液用含2g/L的BSA和1g/L的NaN3的50mmol/L的pH为7.8的Tris-HCl反应缓冲液配制成不同浓度的校准品溶液，进行分装，2～8℃保存；
包被PGⅡ抗体的磁微粒溶液的制备：取直径为50～5000nm的四氧化三铁微球用质量浓度为0.5～2％的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)活化，室温混匀4小时后，用0.05mol/L的pH为...

【专利技术属性】
技术研发人员：任志奇，黄飚，万文成，
申请(专利权)人：浙江博实生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33