CLEC2B基因做为结核病鉴别诊断的应用制造技术

本发明专利技术属于生物医药领域，涉及一种分子标记物CLEC2B在诊断结核病中的应用。本发明专利技术提供检测分子标记物CLEC2B表达水平的试剂在制备诊断结核病的试剂盒的应用。

【技术实现步骤摘要】
CLEC2B基因做为结核病鉴别诊断的应用
本专利技术属于生物医药领域，涉及一种分子标记物CLEC2B在诊断结核病中的应用。
技术介绍
结核病(Tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，M.tb)感染引发的一种严重威胁人类健康的慢性传染性疾病。在全球，每年有逾千万结核新发病例，130万死亡病例。同时，有近四分之一的人感染结核分枝杆菌并长期处于潜伏感染状态，其中5％～10％的人群可能会在一生中发展为活动性结核病。活动性结核患者只是结核感染者的冰山一角，从结核分枝杆菌潜伏感染发展到活动性疾病对结核的传播构成了持久的威胁，因此对结核感染及活动性结核的快速诊断是阻断结核病防控的重要组成部分之一。由于结核分枝杆菌的自身的细胞壁较厚、脂肪酸含量较高、胞内寄生等生物学特点，结核病早期以及快速诊断的灵敏度和检出率均较低，一直未有突破进展。目前，活动性结核诊断主要依据病原学检测方法，针对结核分枝杆菌组分的检测被认为是结核诊断的“金标准”，但临床中仍有相当比例的菌阴结核患者无法被检出。而其他辅助诊断方法也有各自的使用局限性，如人体影像学诊断存在假阳性高、无法区分肺结核与其他肺部感染的缺陷；针对宿主的免疫检测方法，如结核菌素皮肤试验(tuberculinskintest，TST)和γ干扰素释放试验(interferongammareleaseassays，IGRA)只能判定结核菌感染而无法确定是否为活动性结核，且无法区分结核与非结核分枝杆菌感染。因此，如何实现结核病患者的早期和快速诊断、研发可用于结核病早期诊断的、新的特异性生物标识物成为我国和世界性的重大公共卫生领域亟需解决的关键科学问题。目前临床应用的结核病诊断及辅助诊断主要是从病原学和宿主出发建立的的方法，其应用仍存在一定的缺陷和限制条件。(一)病原学检查：患者痰涂片检查，简便易行，但检出率低；痰培养方法，如罗氏斜面培养、MGIT960，虽准确性较高，但培养周期长，操作过程复杂，需要在标准参比实验室中进行；分子生物学检测，如GeneXpert等检测，是针对样本结核菌DNA分子，无法判定结核菌是否为活菌。病原学检测阳性是诊断活动性结核的“金标准”，然而，目前菌阳结核比例只占临床结核病例的30－40％，仍有过半的病例无法应用病原学结果做出诊断。(二)影像学检查：胸部X线检查可以早期发现结核病，而且可以确定病灶的部位、性质、范围，了解发病情况及用于治疗效果的判断，并且开展方便，病人乐于接受；胸部CT可以发现较小的或隐蔽部位的病变，可以弥补一般X线检查的不足。但容易与其他肺部疾病混淆，需要专业医生确证。(三)宿主的免疫反应检测方法，如结核菌素皮肤试验(tuberculinskintest，TST)和γ干扰素释放试验(interferongammareleaseassays，IGRA)只能判定结核菌感染而无法确定是否为活动性结核，且无法区分结核与非结核分枝杆菌感染。因此，迫切需要新的诊断方法，实现结核病的早期和快速诊断，从而达到有效治疗个体，控制、消灭结核传播的目标。CLEC2B(C-typelectindomainfamily2memberB)基因编码C型凝集素，是C型凝集素样超家族一员。此家族基因共同分享蛋白折叠，具有多样性功能，比如细胞粘附，细胞间信号传导，糖蛋白周转，炎性因子和免疫调控。此蛋白的跨膜结构可以具有细胞激活抗原作用，有可选择的接合变异结构。此基因在染色体12P13上，紧密连接CTL/CELD超家族，具有天然杀伤基因复合域。此基因为已知基因，基因序列见参考文献(Hamann,J.etal.AICL:anewactivation-inducedantigenencodedbythehumanNKgenecomplex.1997，Immunogenetics45,295–300。)最新报道其与肿瘤进展，血小板聚集等有关，但目前尚未发现其与结核病相关的研究报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供分子标记物CLEC2B在诊断结核病中的应用。本专利技术所述的标记物能够作为诊断结核病或者检测结核分枝杆菌感染的标识，并且其具有良好的敏感性和特异性。本专利技术所述的分子标记物CLEC2B，为已知基因，能够根据现有方法提取得到。本专利技术更加详细的描述如下：本专利技术目的在于提供，检测分子标记物CLEC2B表达水平的试剂在制备诊断结核病的试剂盒的应用。检测CLEC2B蛋白水平改变在制备诊断结核病试剂盒的应用。其中，检测分子标记物CLEC2B表达水平方法为荧光定量PCR法。本专利技术目的在于提供，检测分子标记物CLEC2B表达水平的试剂制备诊断活动性结核病的试剂盒中的应用。其中，所述应用包括用于区分活动性结核病患者、结核潜伏感染以及非活动性肺结核非潜伏感染者。其中，所述结核病为肺结核或肺外结核。本专利技术目的在于提供，CLEC2B在制备结核病诊断标记物的产品中的应用。本专利技术目的在于提供，CLEC2B在制备诊断结核病的医疗器械中的应用，所述的诊断结核病的医疗器械以CLEC2B作为诊断分子标记物。具体的，本专利技术的试剂盒，包括以下成分：CD15+细胞特异抗体筛选磁珠(Invitrogen.)；RNeasyPlusMiniKit(Qiangen.)SuperScriptTMIVReverseTranscriptase(Invitrogen.)TaqManDNApolymeraseTaqMan探针及基因扩增特异引物本专利技术的另一个目的在于提供检测方法，包括以下步骤：(1)全血样本处理：取人或动物全血进行孵育；(2)磁性分离：分离中性粒细胞并对中性粒细胞进行裂解；(3)总RNA提取：对中性粒细胞的总RNA进行提取；(4)cDNA的合成：对RNA进行反转录，得到样本cDNA，(5)实时荧光定量PCR：以cDNA为模板，使用CLEC2B特异引物，内参引物进行实时荧光定量PCR检测，经过计算即可得到样本中CLEC2B基因的含量。结论：以该研究方法获得宿主体内的基因相对表达量，经统计学分析，得出该基因在活动性结核，结合潜伏感染及非结核感染的宿主中的表达量有明显的变化，可用于活动性结核与非结核感染者，结核潜伏感染与非结核感染者鉴别的分子标识。优选的，本专利技术的检测方法，步骤如下：1)全血样本处理吸取0.8ml混匀全血到5ml流式管中，以1：2的比例向流式管中加入1.6mL的4℃预冷的分离液，吹吸混匀；加入CD15+磁珠并迅速向稀释好的血液中加入一份磁珠，盖紧盖子，将流式管妥善安置在HulaMixer上，4℃，8rpm旋转孵育20min，2)磁性分离⑴取出孵育好的细胞，瞬时离心，在磁力架上静置2min，小心吸去上清；⑵加入1.6mL分离液，轻轻吹匀后转移至对应2mL蛋白低吸附管，磁力架上静置2min，吸去上清，⑶从磁力架上取下，加入1.6mL分离液，轻本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测分子标记物CLEC2B表达水平的试剂在制备诊断结核病的试剂盒的应用。/n

【技术特征摘要】
1.检测分子标记物CLEC2B表达水平的试剂在制备诊断结核病的试剂盒的应用。


2.检测CLEC2B蛋白水平改变在制备诊断结核病试剂盒的应用。


3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，检测分子标记物CLEC2B表达水平方法为荧光定量PCR法。


4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，检测分子标记物CLEC2B表达水平的试剂制备诊断活动性结核病的试剂盒中的应用。


5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括用于区分活动性结核病患者、结核潜伏感染以及非活动性肺结核非潜伏感染者。


6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述结核病为肺结核或肺外结核。


7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，该试剂盒还包括如下组分：
CD15+细胞富集磁珠及相关试剂；
细胞总RNA提取分离柱及相关试剂；
cDNA合成逆转录酶及相关试剂；
CLEC2B序列扩增特异性引物；
实时荧光定量PCR相关试剂。


8.CLEC2B在制备结核病诊断标记物的产品中的应用。


9.CLEC2B在制备诊断结核病的医疗器械中的应用，所述的诊断结核病的医疗器械以CLEC2B作为诊断分子标记物。


10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
1)全血样本处理
吸取0.8ml混匀全血到5ml流式管中，以1：2的比例向流式管中加入1.6mL的4℃预冷的分离液，吹吸混匀；加入CD15+磁珠并迅速向稀释好的血液中加入一份磁珠，盖紧盖子，将流式管妥善安置在HulaMixer上，4℃，8rpm旋转孵育20min，
2)磁性分离
⑴取出孵育好的细胞，瞬...

【专利技术属性】
技术研发人员：金奇，张笑冰，刘立国，
申请(专利权)人：中国医学科学院病原生物学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11