RNF181作为结核病诊断分子标识的用途制造技术

本发明专利技术属于生物医药领域，涉及一种分子标记物RNF181在诊断结核病中的应用。本发明专利技术提供检测分子标记物RNF181表达水平的试剂在制备诊断结核病的试剂盒的应用。

【技术实现步骤摘要】
RNF181作为结核病诊断分子标识的用途
本专利技术属于生物医药领域，涉及一种分子标记物RNF181在诊断结核病中的应用。
技术介绍
结核病(Tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,M.tb)感染引发的一种严重威胁人类健康的慢性传染性疾病，全球将近四分之一的人感染结核分枝杆菌，并长期处于潜伏感染状态，其中5％～10％可能会在一生中发生活动性结核病。由于结核分枝杆菌的自身的细胞壁较厚、脂肪酸含量较高、细胞内寄生等生物学特点，结核病早期以及快速诊断的灵敏度和检出率均较低，一直未有突破进展。目前活动性结核病的诊断主要依据病原学检测和患者影像学诊断。病原学检测被认为是结核诊断的“金标准”，包括患者痰涂片、痰培养以及分子生物学检测方法，主要针对宿主标本中存在的结核分枝杆菌活菌及其基因组份进行检测；然而，现有数据显示菌阳结核比例只占临床结核病例的30－40％，仍有过半的病例无法应用病原学结果做出诊断。另一方面，影像学诊断虽然快捷、灵敏，但存在假阳性高、无法区分肺结核与其他肺部感染的缺陷。而针对宿主的免疫反应检测方法，如结核菌素皮肤试验(tuberculinskintest，TST)和γ干扰素释放试验(interferongammareleaseassays，IGRA)只能判定结核菌感染而无法确定是否为活动性结核，且无法区分结核与非结核分枝杆菌感染。因此，迫切需要新的诊断方法，实现结核病的早期和快速诊断，从而达到有效治疗个体，控制、消灭结核传播的目标。目前临床应用的结核病诊断及辅助诊断主要是从病原学和宿主出发建立的的方法，其应用仍存在一定的缺陷和限制条件。(一)病原学检查：患者痰涂片检查，简便易行，但检出率低；痰培养方法，如罗氏斜面培养、MGIT960，虽准确性较高，但培养周期长，操作过程复杂，需要在标准参比实验室中进行；分子生物学检测，如GeneXpert等检测，是针对样本结核菌DNA分子，无法判定结核菌是否为活菌。病原学检测阳性是诊断活动性结核的“金标准”，然而，目前临床菌阳结核比例只占结核病例的30－40％，仍有过半的病例无法应用病原学结果作出诊断。(二)影像学检查：胸部X线检查可以早期发现结核病，而且可以确定病灶的部位、性质、范围，了解发病情况及用于治疗效果的判断，并且开展方便，病人乐于接受；胸部CT可以发现较小的或隐蔽部位的病变，可以弥补一般X线检查的不足。但容易与其他肺部疾病混淆，需要专业医生确证。(三)宿主的免疫反应检测方法，如结核菌素皮肤试验(tuberculinskintest，TST)和γ干扰素释放试验(interferongammareleaseassays，IGRA)只能判定结核菌感染而无法确定是否为活动性结核，且无法区分结核与非结核分枝杆菌感染。因此，迫切需要新的诊断方法，实现结核病的早期和快速诊断，从而达到有效治疗个体，控制、消灭结核传播的目标。RNF181(RingFingerProtein181(RNF181)基因位于人2号染色体上，编码指环蛋白181，长度153氨基酸,基因序列见参考(Zhang,Q.H.etal.CloningandfunctionalanalysisofcDNAswithopenreadingframesfor300previouslyundefinedgenesexpressedinCD34+hematopoieticstem/progenitorcells.2000，GenomeRes10,1546-1560)1。该蛋白为泛素连接酶。研究报道，该基因表达蛋白与肿瘤抑制有关，体外及动物模型实验显示，其能够抑制细胞生长，降低肿瘤细胞增殖并增加细胞凋亡2。其机制可能与信号转导通路的活化酶(extracellularsignal-regulatedkinase1/2,ERK1/2)/丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activateproteinkinase,MAPK)/有关，在肝细胞癌研究中，通过抑制细胞外信号调节激酶/丝裂原激活激活酶途径抑制肝细胞癌生长3。我们的研究数据显示，相比结核潜伏感染者(LTBI,LatentTuberculosisInfection)和非结核感染对照组(HC，HealthControl)，在活动性结核(ActiveTuberculosis,ATB)患者体内，其基因表达量呈上升状态，且差异显著，可作为活动性结核诊断，区分活动性结核与结核潜伏感染的分子标识。尚无与结核病相关的文献发表及相关专利报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供分子标记物RNF181在诊断结核病中的应用。本专利技术所述的标记物能够作为诊断结核病或者检测结核分枝杆菌感染的标识，并且其具有良好的敏感性和特异性。本专利技术所述的分子标记物RNF181，为已知基因，能够根据现有方法提取得到。本专利技术更加详细的描述如下：检测分子标记物RNF181表达水平的试剂在制备诊断结核病的试剂盒的应用。检测RNF181蛋白水平改变在制备诊断结核病试剂盒的应用。检测分子标记物RNF181表达水平方法为荧光定量PCR法。检测分子标记物RNF181表达水平的试剂制备诊断活动性结核病的试剂盒中的应用。其中，所述应用包括用于区分活动性结核病患者、结核潜伏感染以及非活动性肺结核非潜伏感染者。其中，所述结核病为肺结核或肺外结核。其中，该试剂盒还包括如下组分：CD15+细胞特异抗体筛选磁珠(Invitrogen.)；RNeasyPlusMiniKit(Qiangen.)SuperScriptTMIVReverseTranscriptase(Invitrogen.)TaqManDNApolymeraseTaqMan探针及基因扩增特异引物。本专利技术还提供RNF181在制备结核病诊断标记物的产品中的应用。本专利技术还提供RNF181在制备诊断结核病的医疗器械中的应用，所述的诊断结核病的医疗器械以RNF181作为诊断分子标记物。凡是能够检测体内RNF181基因含量的检测方法都包含在本专利技术之内，如本专利技术提供的以下方法：(1)全血样本处理：取人或动物全血进行孵育；(2)磁性分离：分离中性粒细胞并对中性粒细胞进行裂解；(3)总RNA提取：对中性粒细胞的总RNA进行提取；(4)cDNA的合成：对RNA进行反转录，得到样本cDNA，(5)实时荧光定量PCR：以cDNA为模板，使用RNF181特异引物，内参引物进行实时荧光定量PCR检测，经过计算即可得到样本中RNF181基因的含量。结论：以该研究方法获得宿主体内的基因相对表达量，经统计学分析，得出该基因在活动性结核，结合潜伏感染及非结核感染的宿主中的表达量有明显的变化，可用于活动性结核与非结核感染者，结核潜伏感染与非结核感染者鉴别的分子标识。本专利技术还提供相应的检测方法，步骤如下：1)全血样本处理按照商业化试剂实验说明书操作，吸取0.8m本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测分子标记物RNF181表达水平的试剂在制备诊断结核病的试剂盒的应用。/n

【技术特征摘要】
1.检测分子标记物RNF181表达水平的试剂在制备诊断结核病的试剂盒的应用。


2.检测RNF181蛋白水平改变在制备诊断结核病试剂盒的应用。


3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，检测分子标记物RNF181表达水平方法为荧光定量PCR法。


4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，检测分子标记物RNF181表达水平的试剂制备诊断活动性结核病的试剂盒中的应用。


5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括用于区分活动性结核病患者、结核潜伏感染以及非活动性肺结核非潜伏感染者。


6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述结核病为肺结核或肺外结核。


7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，该试剂盒还包括如下组分：
CD15富集抗体标记磁珠；细胞总RNA提取试剂盒；cDNA反转录酶体系；qPCR荧光定量PCR检测体系，包括TaqPCR多聚酶，缓冲体系，以及TaqAssayRNF181外显子区域特异性检测引物及探针。


8.RNF181在制备结核病诊断标记物的产品中的应用。


9.RNF181在制备诊断结核病的医疗器械中的应用，所述的诊断结核病的医疗器械以RNF181作为诊断分子标记物。


10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
1)全血样本处理
按照商业化试剂实验说明书操作，吸取0.8ml混匀全血到5ml流式管中，以1：2的比例向流式管中加入1.6mL的4℃预冷的分离液，吹吸混匀；加入CD15+磁珠并迅速向稀释好的血液中加入一份磁珠，盖紧盖子，将流式管妥善安置在HulaMixer上，4℃，8rpm旋转孵育20min，
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【专利技术属性】
技术研发人员：金奇，张笑冰，刘立国，
申请(专利权)人：中国医学科学院病原生物学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11