一种鉴定GALT基因同时含两个突变位点位置的试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种鉴定GALT基因同时含两个突变位点位置的试剂盒及方法。所述试剂盒中含有如下引物对：F1：GCGCAGTGGAACCGATCCTCTG；R1：CCAAGGGTACTGGGCACCGA；F2：GCGCAGTGGAACCGATCCTGAC；R2：CCAAGGGTACTGGGCACGCG；所述两个突变位点为C.27G>C、C.482T>C突变位点。本发明专利技术能够鉴定C.27G>C、C.482T>C突变位点是在同一条染色体，还是不同的染色体上，工作量小，耗时短，易操作。

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定GALT基因同时含两个突变位点位置的试剂盒及方法
本专利技术属于生物医学检测
，具体涉及一种鉴定PAH基因同时含两个突变位点(C.27G>C、C.482T>C)位置的试剂盒及方法。
技术介绍
半乳糖血症(GAL)是一种由于半乳糖代谢通路中酶缺陷所引发的常染色体隐性遗传代谢病，其中GALT缺乏引起的半乳糖血症相对常见，也被称为经典型半乳糖血症，由GALT基因致病变异所致。人体内半乳糖主要通过Leloir途径进行代谢，当Leloir途径中的酶发生缺陷时，体内的半乳糖通过旁路代谢途径代谢不能达到完全代偿，使得半乳糖及其旁路代谢产物堆积，引起半乳糖血症。经典型半乳糖血症发生于半乳糖代谢的第2步，即GALT缺乏导致其前体半乳糖-1-磷酸堆积。患儿多在围产期发病，出现腹泻、呕吐、低血糖、肝功能损伤等多种并发症，甚至出现败血症、休克和死亡。半乳糖代谢中间产物具有细胞毒性，可能产生智力落后、生长发育迟缓、共济失调等远期并发症。基因检测发现GALT基因可确诊。不同的GAL基因的突变对GAL活性及结构影响的程度不同。针对于本案中涉及到的两个突变位点，发生在同一条或者不同的染色体上，对患者病情严重程度的影响是不同的。如果两个突变发生在同一条染色体上，则不致病；两个突变分别发生在不同的染色体上，则致病。为了评估疾病的严重程度，鉴定已知的不同的GAL基因突变分布在同一条还是不同染色体上，对疾病的诊断具有决定性作用。现有的方法是提取DNA，构建载体，进行体外表达实验，需要全套的分子生物学及微生物、细胞培养的实验室，难度极大，且工作量大，耗时长，普通实验室难以实施。
技术实现思路
本专利技术旨在克服现有技术的不足，提供一种鉴定GALT基因同时含两个突变位点位置的试剂盒及方法。为了达到上述目的，本专利技术提供的技术方案为：鉴定GALT基因同时含两个突变位点位置的试剂盒中含有如下引物对：F1：GCGCAGTGGAACCGATCCTCTG(SEQIDNO.1)R1：CCAAGGGTACTGGGCACCGA(SEQIDNO.2)F2：GCGCAGTGGAACCGATCCTGAC(SEQIDNO.3)R2：CCAAGGGTACTGGGCACGCG(SEQIDNO.4)；所述两个突变位点为：C.27G>C、C.482T>C突变位点。优选地，引物对按如下排列组合使用：①：F1+R1②：F1+R2③：F2+R1④：F2+R2。优选地，根据C.27G>C、C.482T>C突变分布情况，引物对按如下排列组合使用：①：当待测样本同时含C.27G>C、C.482T>C突变但分布在不同染色体上时：F1+R2或F2+R1；其中，F1和R1是检测野生型的引物；②当待测样本同时含C.27G>C、C.482T>C突变且分布在同一条染色体上时：F2+R2。基于上述试剂盒鉴定同时含C.27G>C、C.482T>C突变位点的方法是采用所述试剂盒中的引物对，在如下次序和条件下进行扩增检测：①：94℃，5min；②：94℃，30s；56℃，30s；72℃，2min；35Cycles；③：72℃，5min；25℃，∝；若扩增后的片段经琼脂糖凝胶电泳出现特异性条带，则表明存在C.27G>C、C.482T>C。本专利技术根据GALT基因已知位点C.27G>C、C.482T>C突变，设计两组引物，第一组：3′端碱基与正常的模板碱基互补，第二组：3′端碱基与突变的模板碱基互补。基于耐热TaqDNA聚合酶缺乏3′→5′外切校正活性的特点，引物3′端的特异碱基分别互补于野生型和突变型等位基因的相对碱基，若此碱基对形成错配，链延伸反应就会因3′，5′-磷酸二酯键形成障碍而受阻，所以其扩增结果为：野生模板阻碍，突变引物放大；或突变模板阻碍，野生引物放大。本专利技术设计了不同的引物对，将提取的模板扩增后进行琼脂糖凝胶电泳从而达到鉴定的目的。本专利技术能够鉴定C.27G>C、C.482T>C突变位点是在同一条染色体，还是不同的染色体上。现有的方法是提取DNA、构建克隆载体、构建克隆载体、体外表达实验，需要全套的分子生物学及微生物、细胞培养的实验室，难度极大，且工作量大，耗时2-3个月，普通实验室难以实施，本专利技术仅需要引物设计、提取DNA、扩增与跑胶，能够在1天内完成所有试验，工作量小，耗时短，易操作成本极低，且普通分子实验室均可操作。附图说明图1为Z、T、S样本电泳图；图2为对比引物对电泳图。具体实施方式1.DNA提取选取3个样本，一个野生型，命名为Z，一个同时含C.27G>C、C.482T>C突变但分布在不同染色体上的样本，命名为T，另一个同时含C.27G>C、C.482T>C突变且分布在同一条染色体上的样本，命名为S。根据试剂QIAampDNABloodMiniKit(250)(凯杰，163030523)说明书提取DNA，保存于-20℃备用。2.PCR扩增根据表1所示反应体系进行片段扩增(商用试剂购自南京诺唯赞生物科技有限公司)。表1反应体系试剂体积(μL)2×VazymeLAmpMasterMix(商用)25ddH2O13PrimersMixer(F+R)8模板DNA(商用)4总体积50按照表1配置反应体系，其中，PrimersMixer(F+R)为扩增引物。本专利技术设计了两组扩增引物序列，如下表2。其中F1、F2序列3’端是针对位点C.27G>C野生型和突变型模板，R1、R2序列3’端是针对位点C.482T>C野生型和突变型模板。表2引物序列按5P浓度1:1F端与R端自由组合，可得4组PrimersMixer(F+R)混合物，如表3。表2引物序列表3PrimersMixer(F+R)引物组合第1组F1+R1第2组F1+R2第3组F2+R1第4组F2+R2所有试剂配制完成后，将每组引物分装成3份，分别加入样本Z、T和S，得12份混合液，按照引物分组命名为Z1-Z4，T1-T4和S1-S4，并按照下列扩增程序进行PCR扩增：[94℃，5min]；[94℃，30s；56℃，30s；72℃，2min；35Cycles]；[72℃，5min；25℃，∝]。3.电泳①配置凝胶取1g琼脂糖凝胶(干粉)加入100ul1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴定GALT基因同时含两个突变位点位置的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有如下引物对：/nF1:GCGCAGTGGAACCGATCCTCTG/nR1:CCAAGGGTACTGGGCACCGA/nF2:GCGCAGTGGAACCGATCCTGAC/nR2:CCAAGGGTACTGGGCACGCG；/n所述两个突变位点为：C.27G>C、C.482T>C突变位点。/n

【技术特征摘要】
1.一种鉴定GALT基因同时含两个突变位点位置的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有如下引物对：
F1:GCGCAGTGGAACCGATCCTCTG
R1:CCAAGGGTACTGGGCACCGA
F2:GCGCAGTGGAACCGATCCTGAC
R2:CCAAGGGTACTGGGCACGCG；
所述两个突变位点为：C.27G>C、C.482T>C突变位点。


2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，引物对按如下排列组合使用：
①：F1+R1
②：F1+R2
③：F2+R1
④：F2+R2。


3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，根据C.27G>C、C.482T>C突变分布情...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭艳华，龚强，余艳，代冰，李慧源，张可可，
申请(专利权)人：长沙金域医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43