基于NRIP1 mRNA的m6A甲基化修饰评估唐氏综合征风险的方法及其应用技术

本发明专利技术公开一种基于NRIP1 mRNA的m6A甲基化修饰评估唐氏综合征风险的方法及其应用。本发明专利技术的方法包括：测量受试者组织样品中的NRIP1 mRNA的m6A甲基化修饰水平得到测量值的步骤；将所述测量值与对照值比较的步骤；判断m6A甲基化的差异化修饰与患唐氏综合征的风险的高低的关系。本发明专利技术可有效地用于唐氏综合征的筛查。

【技术实现步骤摘要】
基于NRIP1mRNA的m6A甲基化修饰评估唐氏综合征风险的方法及其应用
本专利技术属于生物医学
，具体涉及基于NRIP1mRNA的m6A甲基化修饰评估罹患唐氏综合征风险的方法及其应用。
技术介绍
唐氏综合征(DownSyndrome,DS)又称为21-三体综合征(OMIM#190685)，是由于21号染色体整体或部分发生额外的复制而引起的染色体非整倍体疾病，也是导致先天性智力障碍最常见的遗传性疾病之一。唐氏综合征患者有不同程度的认知障碍表型，表现为轻度、中度，甚至重度的智力障碍。尽管经过多年的研究，但其确切机制尚不完全清楚。在全世界范围内，DS的发病率约为活产婴儿的1/1000～1/500。在我国，新生儿中的发病率约为1/800～1/600。中国出生缺陷防治报告(2012年)显示，我国每年新出生的唐氏综合征患者生命周期的总经济负担超过100亿元，危害严重。目前唐氏综合征的致病机制尚不十分清楚，有三种假说：基因剂量失衡假说(Dosageimbalancehypothesis)、放大的发育不稳定假说(Amplifieddevelopmentalinstabilityhypothesis)和关键区域假说。唐氏综合征不同组织中DNA甲基化程度升高，提示表观遗传因素在DS中也发挥重要的作用。唐氏综合征患者的智力障碍表型与额叶和海马的功能缺陷密切相关。唐氏综合征患者大脑皮层的神经解剖异常，大脑皮层神经元的移位引起的进行性神经元细胞的死亡，皮质神经元在突触接触区的长度异常以及突触密度的异常等与DS患者智力障碍的大脑功能异常密切相关。大脑中RNA的m6A修饰水平高，且在大脑发育和神经系统的功能中发挥重要作用，然而其在唐氏综合征大脑中的作用仍不清楚。N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m6A)是腺嘌呤(A)的N6位置添加甲基的修饰，是高等生物各种RNA中最为普遍的修饰，具有动态性和可逆性。mRNA的m6A修饰广泛分布于基因转录区，影响转录、剪接、转运、储存和降解，参与调控各种生物过程。研究发现，胚胎脑组织中有高水平的m6A修饰，并随着大脑的发育过程持续升高。m6A修饰主要发生在RRACH序列中的腺嘌呤上，主要由“编码器(writer)”、“消码器(Eraser)”和“读码器(Reader)”组成。编码器即甲基转移酶，目前这个复合体成分主要有METTL3，METTL14，WTAP和KIAA1429等，其中METTL3和METTL14以二聚体的形式存在，两者协同作用对腺嘌呤位点进行甲基化修饰；而FTO和ALKBH5作为消码器，即去甲基转移酶，可以逆转甲基化，实现m6A修饰的动态平衡。通过RNA甲基化免疫共沉淀高通量测序技术(MethylatedRNAImmunoprecipitationsequencing,MeRIP-seq)检测和分析可以得到m6A修饰在全转录组范围内的分布特征。大脑皮层是由神经干细胞(neuralstemcell)和神经前体/祖细胞(neuralprogenitorcells)分化成的有序形成特定层次的多种类型神经元组成。胚胎小鼠皮质中相当于神经干细胞的放射状神经胶质细胞(radialgliacells，RGCs)，能够产生中间祖细胞(intermediateprogenitorcells,IPCs)，进一步分化为皮质神经祖细胞(corticalneuralprogenitorcells,NPCs)，随后按顺序产生位于不同皮质层的神经元。最近的研究发现，m6A修饰引起神经干细胞、细胞周期、神经元分化相关mRNA的快速更新，以控制皮层神经动态发生过程中不同阶段转录组的组成。这种神经元谱系基因在神经干细胞中已经表达，但其表达在转录后被m6A修饰而抑制的提前转录分布模式(transcriptionalpre-patterning)，对于维持正常的皮质神经发生至关重要。缺少m6A修饰会减弱这些mRNA的降解，影响NPC的分化和细胞周期的进程。核受体相互作用蛋白NRIP1(NuclearReceptorInteractingprotein1)，又称为RIP140(receptor-interactingprotein140)，是一种转录共抑制子，调节参与代谢的多种基因，包括核编码线粒体基因。Nrip1在正常小鼠脑发育过程中持续表达，主要表达在大脑皮质、海马等部位。Nrip1基因敲除小鼠表现出学习和长期记忆缺陷，提示其在认知功能中发挥作用。在DS胚胎来源的成纤维细胞中，NRIP1表达升高，线粒体功能主要调节基因PGC-1α(peroxisomeproliferatoractivatedreceptorgamma,coactivator1alpha)表达降低，耗氧量和ATP含量下降，线粒体Ca2+负荷和ROS增加，导致线粒体功能障碍，而抑制NRIP1后，PGC-1α的表达和线粒体功能得到恢复。在DS中敲低NRIP1的表达，有助于该病的治疗。唐氏综合征胚胎大脑皮层中NRIP1的表达异常升高，然而其升高的程度无法用基因剂量效应解释，其在DS中表达升高的机制仍不十分清楚。
技术实现思路
为探索DS中NRIP1基因表达异常升高的原因以及敲低NRIP1对唐氏综合征的治疗作用，本专利技术通过系统比较DS与正常胚胎大脑皮层组织中RNA的m6A修饰，鉴定出DS大脑皮层组织中m6A差异修饰对NRIP1的调控后，进一步验证了m6A修饰对NRIP1的调控，并探索了其调控机制，至少基于此完成了本专利技术。具体地，本专利技术包括以下内容。本专利技术的第一方面，提供一种基于NRIP1mRNA的m6A甲基化修饰评估罹患唐氏综合征的方法，所述方法包括：a.测量从所述采集的受试者组织样品中的NRIP1mRNA的m6A甲基化修饰水平得到测量值的步骤；b.将所述测量值与对照值比较的步骤；c.当所述测量值低于所述对照值时，将所述受试者诊断为患有唐氏综合征的风险高，当所述测量值等于或高于所述对照值时，将所述受试者诊断为患唐氏综合征的风险低。在某些具体实施方案中，所述对照值为从与所述受试者的年龄相当的正常对象的组织样品获得的值。在某些具体实施方案中，所述方法进一步包括使用体外构建的细胞系进行验证的步骤，所述细胞系包含过表达质粒或siRNA。在某些具体实施方案中，所述组织样品为大脑皮层组织。在某些具体实施方案中，所述m6A甲基化修饰的测量方法包括：提取所述组织RNA，片段化后，使用次氯酸钠和乙醇提取RNA，取1％的片段化RNA作为input对照，剩余片段化RNA与结合有磁珠的m6A抗体孵育，孵育后清洗磁珠，并将其溶于溶解缓冲液中，用次氯酸钠和乙醇提取上清RNA，构建文库，进行高通量测序，根据测序结果，在全转录组范围鉴定出m6A富集峰相关的转录本。本专利技术的第二方面，提供一种用于对鉴定唐氏综合征有用的化合物的方法，所述方法包括：a.测量样品中的NRIP1mRNA的m6A甲基化修饰水平获得第一测量值的步骤；b.测量施用试验化合物后样品中的所述NRIP1mRNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于NRIP1 mRNA的m6A甲基化修饰评估罹患唐氏综合征风险的方法，其特征在于，所述方法包括：/na.测量从受试者采集的组织样品中的NRIP1 mRNA的m6A甲基化修饰水平得到测量值的步骤；/nb.将所述测量值与对照值比较的步骤；/nc.当所述测量值低于所述对照值时，将所述受试者诊断为患唐氏综合征的风险高，当所述测量值等于或高于所述对照值时，将所述受试者诊断为患唐氏综合征的风险低。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于NRIP1mRNA的m6A甲基化修饰评估罹患唐氏综合征风险的方法，其特征在于，所述方法包括：
a.测量从受试者采集的组织样品中的NRIP1mRNA的m6A甲基化修饰水平得到测量值的步骤；
b.将所述测量值与对照值比较的步骤；
c.当所述测量值低于所述对照值时，将所述受试者诊断为患唐氏综合征的风险高，当所述测量值等于或高于所述对照值时，将所述受试者诊断为患唐氏综合征的风险低。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对照值为与所述受试者的年龄相当的正常对象的组织样品获得的值。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述m6A甲基化修饰是指METTL3介导的NRIP1mRNA的m6A甲基化修饰。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组织样品为大脑皮层组织。


5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述m6A甲基化修饰水平的测量方法包括：提取所述组织RNA，加入片段化缓冲液，在适于片段化的条件下加入EDTA进行片段化，使用次氯酸钠和乙醇提取片段化后的RNA，取1％的片段化RNA作为对照，剩余片段化RNA与结合有磁珠的m6A抗体孵育，孵育后清洗磁珠，溶于溶解缓冲液中，用次氯...

【专利技术属性】
技术研发人员：时伟丽，杨帆，
申请(专利权)人：时伟丽，杨帆，
类型：发明
国别省市：河南;41