一种鉴定PAH基因同时含两个突变位点位置的试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种鉴定PAH基因同时含两个突变位点位置的试剂盒及方法。所述试剂盒中含有如下引物对：F1：GTGTAAATTACTTACTGTTAATGGAATCAG；R1：CCTCTATTACGTGGCAGAGAGTT；F2：GTGTAAATTACTTACTGTTAATGGAATCAT；R2：CCTCTATTACGTGGCAGAGAGTA；所述两个突变位点为：C.1301C>A、C.1174T>A突变位点。本发明专利技术能够鉴定C.1301C>A、C.1174T>A突变位点是在同一条染色体，还是不同的染色体上，工作量小，耗时短，易操作。

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定PAH基因同时含两个突变位点位置的试剂盒及方法
本专利技术属于生物医学检测
，具体涉及一种鉴定PAH基因同时含两个突变位点(C.1301C>A、C.1174T>A)位置的试剂盒及方法。
技术介绍
苯丙氨酸羟化酶(PAH)在苯丙氨酸代谢途径中起重要的作用，当PAH缺乏或者活性减低可导致苯丙氨酸代谢障碍，从而使苯丙氨酸通过其他代谢途径产生苯丙酮酸等有害物质。这些有害的代谢产物达到异常增高的水平后，积蓄于组织、血浆和脑脊液中，并大量从尿中排出，产生苯丙酮尿症(PKU)。PAH基因突变引起经典型PKU，占所有患者的90％左右，本病遗传方式为常染色体隐性遗传，所以对PKU患者进行PAH基因的筛查，能及早的鉴别，诊断，从而达到早发现、早治疗的效果。不同的PAH基因的突变对PAH活性及结构影响的程度不同。针对于本案中涉及到的两个突变位点，发生在同一条或者不同的染色体上，对患者病情严重程度的影响是不同的。如果两个突变发生在同一条染色体上，则不致病；两个突变分别发生在不同的染色体上，则致病。为了评估疾病的严重程度，鉴定已知的不同的PAH基因突变分布在同一条还是不同染色体上，对疾病的诊断具有决定性作用。现有的方法是提取DNA，构建载体，进行体外表达实验，需要全套的分子生物学及微生物、细胞培养的实验室，难度极大，且工作量大，耗时2-3个月，普通实验室难以实施。
技术实现思路
本专利技术旨在克服现有技术的不足，提供一种鉴定PAH基因同时含两个突变位点位置的试剂盒及方法。为了达到上述目的，本专利技术提供的技术方案为：鉴定PAH基因同时含两个突变位点位置的试剂盒中含有如下引物对：F1:GTGTAAATTACTTACTGTTAATGGAATCAG(SEQIDNO.1)R1:CCTCTATTACGTGGCAGAGAGTT(SEQIDNO.2)F2:GTGTAAATTACTTACTGTTAATGGAATCAT(SEQIDNO.3)R2:CCTCTATTACGTGGCAGAGAGTA(SEQIDNO.4)；所述两个突变位点为：C.1301C>A、C.1174T>A突变位点。优选地，引物对按如下排列组合使用：①：F1+R1②：F1+R2③：F2+R1④：F2+R2。优选地，根据C.1301C>A、C.1174T>A突变分布情况，引物对按如下排列组合使用：①：当待测样本同时含C.1301C>A、C.1174T>A突变但分布在不同染色体上时：F1+R2或F2+R1；其中，F1和R1是检测野生型的引物；②当待测样本同时含C.1301C>A、C.1174T>A突变且分布在同一条染色体上时：F2+R2。基于上述试剂盒鉴定同时含C.1301C>A、C.1174T>A突变位点的方法是采用所述试剂盒中的引物对，在如下次序和条件下进行扩增检测：①：94℃,5min；②：94℃,30s；55℃,30s；72℃,2min；35Cycles；③：72℃,7min；25℃,∝；若扩增后的片段经琼脂糖凝胶电泳出现特异性条带，则表明存在C.1301C>A、C.1174T>A突变位点。本专利技术根据PAH基因已知位点C.1301C>A、C.1174T>A突变，设计两组引物，第一组：3′端碱基与正常的模板碱基互补，第二组：3′端碱基与突变的模板碱基互补。基于耐热TaqDNA聚合酶缺乏3′→5′外切校正活性的特点，引物3′端的特异碱基分别互补于野生型和突变型等位基因的相对碱基，若此碱基对形成错配，链延伸反应就会因3′，5′-磷酸二酯键形成障碍而受阻，所以其扩增结果为：野生模板阻碍，突变引物放大；或突变模板阻碍，野生引物放大。本专利技术设计了不同的引物对，将提取的模板扩增后进行琼脂糖凝胶电泳从而达到鉴定的目的。本专利技术能够鉴定C.1301C>A、C.1174T>A突变位点是在同一条染色体，还是不同的染色体上。现有的方法是提取DNA、构建克隆载体、构建克隆载体、体外表达实验，需要全套的分子生物学及微生物、细胞培养的实验室，难度极大，且工作量大，耗时2-3个月，普通实验室难以实施，本专利技术仅需要引物设计、提取DNA、扩增与跑胶，能够在1天内完成所有试验，工作量小，耗时短，易操作成本极低，且普通分子实验室均可操作。附图说明图1为Z、T样本电泳图；图2为S样本电泳图；图3为对比引物对电泳图。具体实施方式1.DNA提取选取3个样本，一个野生型，命名为Z，一个同时含C.1301C>A、C.1174T>A突变但分布在不同染色体上的样本，命名为T，另一个同时含C.1301C>A、C.1174T>A突变且分布在同一条染色体上的样本，命名为S。根据试剂QIAampDNABloodMiniKit(250)(凯杰，163030523)说明书提取DNA，保存于-20℃备用。2.PCR扩增根据表1所示反应体系进行片段扩增(商用试剂购自南京诺唯赞生物科技有限公司)。表1反应体系试剂体积(μL)2×VazymeLAmpMasterMix(商用)25ddH2O13PrimersMixer(F+R)8模板DNA(商用)4总体积50按照表1配置反应体系，其中，PrimersMixer(F+R)为扩增引物。本专利技术设计了两组扩增引物序列，如下表2。其中F1、F2序列3’端是针对位点C.1301C>A野生型和突变型模板，R1、R2序列3’端是针对位点C.1174T>A野生型和突变型模板。表2引物序列按5P浓度1:1F端与R端自由组合，可得4组PrimersMixer(F+R)混合物，如表3。表2引物序列表3PrimersMixer(F+R)引物组合第1组F1+R1第2组F1+R2第3组F2+R1第4组F2+R2所有试剂配制完成后，将每组引物分装成3份，分别加入样本Z、T和S，得12份混合液，按照引物分组命名为Z1-Z4，T1-T4和S1-S4，并按照下列扩增程序进行PCR扩增：[94℃，5min]；[94℃，30s；55℃，30s；72℃，2min；35Cycles]；[72℃，7min；25℃,∝]。3.电泳①配置凝胶取1g琼脂糖凝胶(干粉)加入100ul1XTAE溶液混合。将混合液放入微波炉，设置微波炉“本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴定PAH基因同时含两个突变位点位置的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有如下引物对：/nF1:GTGTAAATTACTTACTGTTAATGGAATCAG/nR1:CCTCTATTACGTGGCAGAGAGTT/nF2:GTGTAAATTACTTACTGTTAATGGAATCAT/nR2:CCTCTATTACGTGGCAGAGAGTA；/n所述两个突变位点为：C.1301C>A、C.1174T>A突变位点。/n

【技术特征摘要】
1.一种鉴定PAH基因同时含两个突变位点位置的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有如下引物对：
F1:GTGTAAATTACTTACTGTTAATGGAATCAG
R1:CCTCTATTACGTGGCAGAGAGTT
F2:GTGTAAATTACTTACTGTTAATGGAATCAT
R2:CCTCTATTACGTGGCAGAGAGTA；
所述两个突变位点为：C.1301C>A、C.1174T>A突变位点。


2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，引物对按如下排列组合使用：
①：F1+R1
②：F1+R2
③：F2+R1
④：F2+R2。


3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，根据C.1301C>A、C.1174T&...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚强，周梅华，代冰，余艳，李慧源，杨瑶，
申请(专利权)人：长沙金域医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43