NDUFB1作为结核病诊断分子标识的用途制造技术

本发明专利技术属于生物医药领域，涉及一种分子标记物NDUFB1在诊断结核病中的应用。本发明专利技术提供检测分子标记物NDUFB1表达水平的试剂在制备诊断结核病的试剂盒的应用。

【技术实现步骤摘要】
NDUFB1作为结核病诊断分子标识的用途
本专利技术属于生物医药领域，涉及一种分子标记物NDUFB1在诊断结核病中的应用。
技术介绍
结核病(Tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,M.tb)感染引发的一种严重威胁人类健康的慢性传染性疾病，全球将近四分之一的人感染结核分枝杆菌，并长期处于潜伏感染状态，其中5％～10％可能会在一生中发生活动性结核病。活动性结核患者只是结核感染者的冰山一角，从结核分枝杆菌潜伏感染发展到活动性疾病对结核病的传播构成了持久的威胁，因此对人的结核菌感染及发病状态的快速诊断是结核病防控的重要工作。由于结核分枝杆菌的自身的细胞壁较厚、脂肪酸含量较高、细胞内寄生等生物学特点，结核病早期以及快速诊断的灵敏度和检出率均较低，一直未有突破进展。目前，临床应用的结核病诊断及辅助诊断主要是从病原学和宿主出发建立的的方法，其应用仍存在一定的缺陷和限制条件。(一)病原学检查：患者痰涂片检查，简便易行，但检出率低；痰培养方法，如罗氏斜面培养、MGIT960，虽准确性较高，但培养周期长，操作过程复杂，需要在标准参比实验室中进行；分子生物学检测，如GeneXpert等检测，是针对样本结核菌DNA分子，无法判定结核菌是否为活菌。病原学检测阳性是诊断活动性结核的“金标准”，然而，目前菌阳结核比例只占临床结核病例的30－40％，仍有过半的病例无法应用病原学结果做出诊断。(二)影像学检查：胸部X线检查可以早期发现结核病，而且可以确定病灶的部位、性质、范围，了解发病情况及用于治疗效果的判断，并且开展方便，病人乐于接受；胸部CT可以发现较小的或隐蔽部位的病变，可以弥补一般X线检查的不足。但容易与其他肺部疾病混淆，需要专业医生确证。(三)宿主的免疫反应检测方法，如结核菌素皮肤试验(tuberculinskintest，TST)和γ干扰素释放试验(interferongammareleaseassays，IGRA)只能判定结核菌感染而无法确定是否为活动性结核，且无法区分结核与非结核分枝杆菌感染。因此，迫切需要新的诊断方法，实现结核病的早期和快速诊断，从而达到有效治疗个体，控制、消灭结核传播的目标。从宿主应对M.tuberculosis感染相关的机体反应出发，寻找其中特异性变化的基因，是发现新的分子诊断标识的未来趋势和研究热点。NDUFB1基因(NADHdehydrogenase[ubiquinone]1betasubcomplexsubunit1)位于人类第14号染色体的q32.12区域，基因表达蛋白编码58个氨基酸，基因序列见参考文献(Loeffen,J.L.etal.cDNAofeightnuclearencodedsubunitsofNADH:ubiquinoneoxidoreductase:humancomplexIcDNAcharacterizationcompleted.1998，BiochemBiophysResCommun253,415-422)1。其功能为编码线粒体膜复合物I的呼吸链NADH脱氢酶β亚单位1。有研究报道，在经生育酚治疗后的慢性C肝病人中基因表达量有明显的上升。我们的研究结果显示，相比结核潜伏感染者(LTBI,LatentTuberculosisInfection)与非结核感染对照组(HC，HealthControl)，在活动性结核(ActiveTuberculosis,ATB)患者体内，其基因表达量呈上升状态，同时，ATB组内的表达量显著高于其他肺部感染(PN，pneumonia)组。因此，该基因可作为活动性结核诊断，鉴别活动性结核其他肺部感染的分子标识。目前尚未发现其与结核病相关的研究报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供分子标记物NDUFB1在诊断结核病中的应用。本专利技术所述的标记物能够作为诊断结核病或者检测结核分枝杆菌感染的标识，并且其具有良好的敏感性和特异性。本专利技术所述的分子标记物NDUFB1，为已知基因，能够根据现有方法提取得到。本专利技术更加详细的描述如下：检测分子标记物NDUFB1表达水平的试剂在制备诊断结核病的试剂盒的应用。检测NDUFB1蛋白水平改变在制备诊断结核病试剂盒的应用。检测分子标记物NDUFB1表达水平方法为荧光定量PCR法。检测分子标记物NDUFB1表达水平的试剂制备诊断活动性结核病的试剂盒中的应用。其中，所述应用包括用于区分活动性结核病患者、结核潜伏感染以及非活动性肺结核非潜伏感染者。其中，所述结核病为肺结核或肺外结核。其中，该试剂盒还包括如下组分：CD15+细胞特异抗体筛选磁珠(Invitrogen.)；RNeasyPlusMiniKit(Qiangen.)SuperScriptTMIVReverseTranscriptase(Invitrogen.)TaqManDNApolymeraseTaqMan探针及基因扩增特异引物。本专利技术还提供NDUFB1在制备结核病诊断标记物的产品中的应用。本专利技术还提供NDUFB1在制备诊断结核病的医疗器械中的应用，所述的诊断结核病的医疗器械以NDUFB1作为诊断分子标记物。凡是能够检测体内NDUFB1基因含量的检测方法都包含在本专利技术之内，如本专利技术提供的以下方法：(1)全血样本处理：取人或动物全血进行孵育；(2)磁性分离：分离中性粒细胞并对中性粒细胞进行裂解；(3)总RNA提取：对中性粒细胞的总RNA进行提取；(4)cDNA的合成：对RNA进行反转录，得到样本cDNA，(5)实时荧光定量PCR：以cDNA为模板，使用NDUFB1特异引物，内参引物进行实时荧光定量PCR检测，经过计算即可得到样本中NDUFB1基因的含量。结论：以该研究方法获得宿主体内的基因相对表达量，经统计学分析，得出该基因在活动性结核，结合潜伏感染及非结核感染的宿主中的表达量有明显的变化，可用于活动性结核与非结核感染者，结核潜伏感染与非结核感染者鉴别的分子标识。本专利技术还提供相应的检测方法，步骤如下：1)全血样本处理按照商业化试剂实验说明书操作，吸取0.8ml混匀全血到5ml流式管中，已1：2的比例向流式管中加入1.6mL的4℃预冷的分离液，吹吸混匀；加入CD15+磁珠(Invitrogen，US)并迅速向稀释好的血液中加入一份磁珠，盖紧盖子，将流式管妥善安置在HulaMixer(Invitrogen，US)上，4℃，8rpm旋转孵育20min，2)磁性分离⑴取出孵育好的细胞，瞬时离心，在磁力架上静置2min，小心吸去上清；⑵加入1.6mL分离液，轻轻吹匀后转移至对应2mL蛋白低吸附管，磁力架上静置2min，吸去上清，⑶从磁力架上取下，加入1.6mL分离液，轻轻吹匀，磁力架上静置2min，吸去上清，重复1次，⑷加入350μL的BufferRLT(Qiagen,Germany本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测分子标记物NDUFB1表达水平的试剂在制备诊断结核病的试剂盒的应用。/n

【技术特征摘要】
1.检测分子标记物NDUFB1表达水平的试剂在制备诊断结核病的试剂盒的应用。


2.检测NDUFB1蛋白水平改变在制备诊断结核病试剂盒的应用。


3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，检测分子标记物NDUFB1表达水平方法为荧光定量PCR法。


4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，检测分子标记物NDUFB1表达水平的试剂制备诊断活动性结核病的试剂盒中的应用。


5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括用于区分活动性结核病患者、结核潜伏感染以及非活动性肺结核非潜伏感染者。


6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述结核病为肺结核或肺外结核。


7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，该试剂盒还包括如下组分：
CD15+细胞特异抗体筛选磁珠及相关试剂；
细胞总RNA提取试剂盒及相关试剂
cDNA反转录酶及相关试剂
TaqManDNApolymerase
qPCR荧光定量PCR检测体系，包括PCR多聚酶，缓冲体系，以及

AssayNDUFB1外显子区域特异性检测引物及探针。


8.NDUFB1在制备结核病诊断标记物的产品中的应用。


9.NDUFB1在制备诊断结核病的医疗器械中的应用，所述的诊断结核病的医疗器械以NDUFB1作为诊断分子标记物。


10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
1)全血样本处理
按照商业化试剂实验说明书操作，吸取0.8ml混匀全血到5ml流式管中，已1：2的比例向流式管中加入1.6mL的4℃预冷的分离液，吹吸混匀；加入CD15+磁珠(Invitrogen，US)并迅速向稀释好的血液中加入一份磁珠，盖紧盖子，将流式管妥善安置在HulaMixer(Invitrogen，US)上，4℃，8...

【专利技术属性】
技术研发人员：金奇，张笑冰，刘立国，
申请(专利权)人：中国医学科学院病原生物学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11