改造的Fc片段，包含其的抗体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及改造的Fc片段，包含其的抗体及其应用。所述Fc片段为人IgG1来源，并且所述Fc片段的恒定区CH2结构域包含多处替换。该替换可以显著降低Fc片段与Fcγ受体(FcγR)的结合能力，减少抗体(如抗CD3抗体)对T细胞的非特异性激活。

【技术实现步骤摘要】
改造的Fc片段，包含其的抗体及其应用本申请是国际申请号“PCT/CN2019/075881”，国际申请日“2019年2月22日”，中国申请号“201980003210.7”，进入中国国家阶段日期2019年12月25日，专利技术名称为“改造的Fc片段，包含其的抗体及其应用”的分案申请。
本专利技术涉及抗体领域。具体地，涉及改造的Fc片段，包含其的抗体。
技术介绍
人的天然抗体，如IgG1，IgG2，IgG3和IgG4都具有与FcγR结合的能力，人的FcγR分为FcγRI(CD64)，FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)三类，其中每一类受体对应表达在不同的单核细胞表面，并且每一类受体又分为a、b、c等多种亚型。天然抗体通过自身的Fc与FcγR结合产生如下免疫效应功能：抗体依赖型细胞介导的细胞毒性(ADCC)，抗体依赖型细胞介导的细胞吞噬(ADCP)，以及补体介导的细胞毒性(CDC)等。在抗体药物研究过程中，对于有些类型的抗体，需要降低与FcγR结合能力，以减少ADCC、ADCP和CDC的产生，从而降低抗体的毒性和副作用。在一些特殊情况下，比如抗CD3的抗体，特别是多功能抗体可以同时靶向肿瘤细胞和CD3表达的T淋巴细胞，需要尽量去除与FcγR的结合，从而减少T细胞的非特异性激活产生的大量细胞因子释放所带来的毒副作用。多功能抗体(multifunctionalantibody)为具有多种不同结合特异性的抗体或抗体类分子。多功能抗体广泛应用于生物医学，尤其是针对肿瘤的免疫治疗中。目前，对于免疫治疗研究的一个关注焦点为如何利用多功能抗体介导的细胞毒性来杀死目标细胞。多功能抗体可设计为同时靶向作用于肿瘤细胞和效应细胞，同时激发效应细胞使其杀灭肿瘤细胞。多功能抗体可通过例如化学工程、细胞工程以及基因工程的方法制备。基因工程的优势在于能够容易地改造抗体，使得能够设计和生产许多不同形式的多功能抗体片段，包括双体，串联的(tanderm)ScFv和单链双体及其衍生物(参见Jin和Zhu，于“ThedesignandengineeringofIgG-Likebispecificantibodies”，REKontermann(编)，Bispecificantibodies)。由于这些多功能抗体不具有IgGFc结构域，因此它们的小的尺寸使得它们渗透进入肿瘤的能力增强，但它们在体内具有相当短的半衰期并且缺乏ADCC作用，该作用与抗体的恒定区相关联。现阶段已有一些Fc改造的技术，可以降低Fc与FcγR的结合能力，如：(1)在文献“CurrOpinBiotechnol.2011Dec；22(6)：858-67.BypassingglycosylationengineeringaglycosylatedfulllengthIgGantibodiesforhumantherapy”中提到，通过对人IgG1的Fc第297位的天冬酰胺(N297)进行突变，可以有效去除Fc的糖基化，从而降低与FcγR的结合；(2)在专利申请“WO2009100309A2”中，提到对人IgG1的Fc第234位(亮氨酸L234)、第235位(亮氨酸L235)和第331位(脯氨酸P331)分别突变为苯丙氨酸、谷氨酸和丝氨酸(L234F/L235E/P331S)，从而降低与FcγR的结合；(3)在专利申请“US20130078249A1”提到，通过对人IgG1的Fc第234位(亮氨酸L234)、第235位(亮氨酸L235)和第331位(脯氨酸P329)分别突变为丙氨酸、丙氨酸和甘氨酸(L234A/L235A/P329G)，能降低与FcγR的结合；(4)在文章“ProteinEngDesSel.2016Oct；29(10)：457-466.NovelhumanIgG1andIgG4Fc-engineeredantibodieswithcompletelyabolishedimmuneeffectorfunctions”中提到，对人IgG1的Fc第234位亮氨酸(L234)和第235位亮氨酸(L235)分别突变为丙氨酸和丙氨酸(L234A/L235A)，能降低与FcγR的结合能力；(5)在专利申请“WO2011066501A1”中提到，通过对人的Ig62的Fc第234位(缬氨酸V234)、第237位(甘氨酸G237)、第238位(脯氨酸P238)、第268位(组氨酸H268)、第309位(缬氨酸V309)、第330位(丙氨酸A330)和第331位(脯氨酸P331)分别突变为丙氨酸、丙氨酸、丝氨酸、丙氨酸、亮氨酸、丝氨酸和丝氨酸(V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S)，能降低与FcγR的结合能力。但是，上述对于Fc改造的技术，应用于多功能抗体结构中时，并不能完全消除抗CD3抗体对T细胞的非特异性激活(如人IgG1中，L234F/L235E/P331S突变、L234A/L235A/P329G突变和L234A/L235A突变)，并且某些位点的改造，会导致抗体的稳定性变差(如人IgG1的第297位天冬酰胺的突变去除糖基化)，另外在文献“JImmunol2003；170：3134-3138；HumanIgG2canformcovalentdimers.”中提到人IgG2容易发生二聚化形成分子量达300kD的四价复合物，而对人IgG2进行多达7个位置的氨基酸突变(如V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S)，存在增加免疫原性的风险。为解决上述问题，既需要降低Fc与FcγR结合能力以去除非特异性激活T细胞(如抗CD3抗体)，也需要避免抗体的稳定性变差、免疫原性变强，本专利技术通过一种新的Fc改造方法，将人IgG1的Fc中CH2结构域整体替换为人IgG2的CH2结构域，同时对该结构域的氨基酸残基进行突变，可以显著降低抗体与FcγR的结合能力，更有效地消除抗体(如抗CD3抗体)对T细胞的非特异性激活，而维持抗体良好的稳定性。
技术实现思路
本专利技术提供了一种Fc改造的方法，将人IgG1的恒定区CH2结构域整体替换为人IgG2的CH2结构域，优选对替换后的CH2结构域进行若干氨基酸残基的替换。该CH2的残基替换可以有效降低抗体与FcγR的结合能力。当抗体的一个结合位点是CD3时，该CH2的替换也可以显著降低抗体对T细胞的非特异性激活。本专利技术提供了3种多功能抗体及制备方法，具体的多功能抗体结构见图1-3。具体地，本专利技术涉及以下几个方面：1.多肽，其包含修饰的Fc片段，或由其组成，其中所述Fc片段为人IgG1来源，并且所述Fc片段的恒定区CH2结构域被替换为人IgG2的CH2结构域，其中人IgG2的CH2结构域如SEQIDNO：94所示。2.上述1所述的多肽，其中所述Fc片段的CH2结构域进一步包含选自由以下位置组成的组的突变：根据Kabat编号的C229，D265，D270或其任意组合。3.上述2所述的多肽，其中所述突变为C229位置的突变，优本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种非对称双特异性抗体，其特征在于：所述的抗体包含轻链、重链和融合肽1，融合肽1包含scFv和Fc片段，所述抗体具有轻链-重链配对，和重链-融合肽1配对，每个配对形成链间二硫键；轻链-重链配对靶向肿瘤抗原CD38；融合肽1中ScFv靶向免疫细胞抗原，所述免疫细胞抗原为CD3；所述重链和融合肽包含的Fc片段为人IgG1来源，并且所述Fc片段的恒定区CH2结构域被替换为人IgG2的CH2结构域，其中人IgG2的CH2结构域如SEQ ID NO：94所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种非对称双特异性抗体，其特征在于：所述的抗体包含轻链、重链和融合肽1，融合肽1包含scFv和Fc片段，所述抗体具有轻链-重链配对，和重链-融合肽1配对，每个配对形成链间二硫键；轻链-重链配对靶向肿瘤抗原CD38；融合肽1中ScFv靶向免疫细胞抗原，所述免疫细胞抗原为CD3；所述重链和融合肽包含的Fc片段为人IgG1来源，并且所述Fc片段的恒定区CH2结构域被替换为人IgG2的CH2结构域，其中人IgG2的CH2结构域如SEQIDNO：94所示。


2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于：其中所述Fc片段的CH2结构域进一步包含选自由以下位置组成的组的突变：根据Kabat编号的C229，D265，D270或其任意组合。


3.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于：所述突变为C229位置的突变，优选所述突变选自由以下各项组成的组：C229A，C229G，C229P，C229S，C229V，C229L，C229I，C229T，C229M，C229N，C229Q，C229D，C229E，C229K，C229R，C229F，C229Y，C229W或C229H，优选C229S，C229A，C229G和C229P。


4.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于：所述突变为D265位置的突变，优选所述突变选自由以下各项组成的组：D265A，D265G，D265P，D265S，D265V，D265L，D265I，D265T，D265M，D265N，D265Q，D265E，D265K，D265R，D265F，D265Y，D265W或D265H，优选D265A。


5.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于：所述突变为D270位置的突变，优选所述突变选自由以下各项组成的组：D270A，D270G，D270P，D270S，D270V，D270L，D270I，D270T，D270M，D270N，D270Q，D270E，D270K，D270R，D270F，D270Y，D270W或D270H，优选D270A。


6.根据权利要求2～5中任一项所述的抗体，其特征在于：所述突变为位置C229，D265和D270的任意两种组合的突变，或是位置C229，D265和D270的组合突变，优选位置D265和D270的组合的突变。


7.根据权利要求2～5中任一项所述的抗体，其特征在于：所述Fc片段的CH2结构域进一步包含选自以下位置组成的组的突变：G327，T339或其组合。


8.根据权利要求7所述的抗体，其特征在于：所述突变选自G327A，G327V，G327L，G327I和/或T339A。


9.根据权利要求2～8中任一项所述的抗体，其特征在于：所述突变选自C229P/G327A，C229P/T339A，D270A/G327A，D270A/T339A，D270A/G327A/T339A或C229P/D265A/D270A。


10.根据权利要求2～5中任一项所述的抗体，其特征在于：所述Fc片段的CH2结构域的序列选自SEQIDNO：94-101和122-176组成的组。


11.根据权利要求1～10中任一项所述的抗体，其特征在于：所述抗体具有两个不同的CH3，两个CH3之间以“杵-入-臼”或/和“盐桥”方式配对形成异二聚体，优选CH3结构域的序列如SEQIDNO：102-115所示。


12.根据权利要求1～11中任一项所述的抗体，其中所述轻链-重链配对或VLm-VHm配对选自以下组成的组：
(3)靶向肿瘤抗原CD38的SEQIDNO：16和SEQIDNO：15；
(4)靶向肿瘤抗原CD38的SEQIDNO：18和SEQIDNO：17；
(5)靶向肿瘤抗原CD38的SEQIDNO：20和SEQIDNO：19；
(17)靶向免疫抗原CD3的SEQIDNO：2和SEQIDNO：1；
(18)靶向免疫抗原CD3的SEQIDNO：4和SEQIDNO：3；
(19)靶向免疫抗原CD3的SEQIDNO：6和SEQIDNO：5；
(20)靶向免疫抗原CD3的SEQIDNO：8和SEQIDNO：7；和
(21)靶向免疫抗原CD3的SEQIDNO：10和SEQIDNO：9。


13.根据权利要求1～12中任一项所述的抗体，其中所述抗体选自以下各项组成的组：
(3)CD38-M1-G2，其包含融合肽1，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽1包含SEQIDNO：1，SEQIDNO：54，SEQIDNO：2，SEQIDNO：71，SEQIDNO：94和SEQIDNO：109，或由其组成；重链包含SEQIDNO：15，SEQIDNO：82，SEQIDNO：66，SEQIDNO：94和SEQIDNO：108，或由其组成；轻链包含SEQIDNO：16和SEQIDNO：75，或由其组成；
(4)CD38-M1-SG2，其包含融合肽1，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽1包含SEQIDNO：1，SEQIDNO：54，SEQIDNO：2，SEQIDNO：71，SEQIDNO：95和SEQIDNO：109，或由其组成；重链包含SEQIDNO：15，SEQIDNO：82，SEQIDNO：66，SEQIDNO：95和SEQIDNO：108，或由其组成；轻链包含SEQIDNO：16和SEQIDNO：75，或由其组成；
(5)CD38-M1-SG2-1，其包含融合肽1，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽1包含SEQIDNO：1，SEQIDNO：54，SEQIDNO：2，SEQIDNO：71，SEQIDNO：95和SEQIDNO：109，或由其组成；重链包含SEQIDNO：19，SEQIDNO：82，SEQIDNO：66，SEQIDNO：95和SEQIDNO：108，或由其组成；轻链包含SEQIDNO：20和SEQIDNO：75，或由其组成；
(6)CD38-M1-G2-3，其包含融合肽1，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽1包含SEQIDNO：1，SEQIDNO：54，SEQIDNO：2，SEQIDNO：71，SEQIDNO：94和SEQIDNO：1O9，或由其组成；重链包含SEQIDNO：19，SEQIDNO：82，SEQIDNO：66，SEQIDNO：94和SEQIDNO：108，或由其组成；轻链包含SEQIDNO：20和SEQIDNO：75，或由其组成；
(7)CD38-M1-SG2-2，其包含融合肽1，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽1包含SEQIDNO：1，SEQIDNO：54，SEQIDNO：2，SEQIDNO：71，SEQIDNO：95和SEQIDNO：109，或由其组成；重链包含SEQIDNO：17，SEQIDNO：82，SEQIDNO：66，SEQIDNO：95和SEQIDNO：108，或由其组成；轻链包含SEQIDNO：18和SEQIDNO：75，或由其组成；
(8)CD38-M1-G2-2，其包含融合肽1，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽1包含SEQIDNO：1，SEQIDNO：54，SEQIDNO：2，SEQIDNO：71，SEQIDNO：94和SEQIDNO：109，或由其组成；重链包含SEQIDNO：17，SEQIDNO：82，SEQIDNO：66，SEQIDNO：94和SEQIDNO：108，或由其组成；轻链包含SEQIDNO：18和SEQIDNO：75，或由其组成；
(9)CD38-M1-G2-1，其包含融合肽1...

【专利技术属性】
技术研发人员：张敬，方丽娟，严永祥，曾亮，周鹏飞，
申请(专利权)人：石家庄石友生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：河北;13