一种重组人胰岛素及其纯化制备方法技术

本发明专利技术为一种纯化制备重组人胰岛素的方法，特别涉及一种可溶性表达重组人胰岛素的纯化制备方法。首先设计合成了重组人胰岛素原的全长序列，将其连接到含有SUMO分子伴侣肽的表达载体中，将构建好的表达载体导入适当的宿主细胞，培养诱导后重组人胰岛素原融合蛋白以可溶性形式表达，经亲和色谱、酶切、离子交换、反相色谱等步骤纯化，最终获得纯度在98％以上的重组人胰岛素。本发明专利技术与现有的制备人胰岛素方法相比，具有操作简单、收率高、生产成本低等优势，适合大规模工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
一种重组人胰岛素及其纯化制备方法
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种制备重组人胰岛素的方法，特别涉及一种可溶性表达和纯化重组人胰岛素的制备方法。
技术介绍
糖尿病是全球范围内威胁人类健康的一类重大疾病。全球糖尿病患者的数量正逐年增长，预计2030年将达到5.52亿。糖尿病药物种类很多，其中胰岛素是至今仍广泛使用的治疗糖尿病的特效药物，因此胰岛素的消耗量也会逐年递增。胰岛素的临床用药量大，每个糖尿病患者每天需使用胰岛素约1.5-2.0mg，且需终身用药，因此开发一种用于大规模低成本制备胰岛素的工艺方法具有良好的商业价值和社会意义。目前重组人胰岛素及其类似物的生产采用了两套系统，其一是用酵母系统，其二是用大肠杆菌系统。相对细菌，酵母菌生长慢，导致生产周期长，且表达水平一般。应用大肠杆菌表达重组人胰岛素生产的方式主要包括三种方式：一种是重组大肠杆菌分别表达胰岛素的A链和B链，表达产物经溴化氰(brominecyanide,CNBr)切下融合导肽片段后，得到的A链和B链经纯化后再进行复性，最后得到有活性的重组人胰岛素。由于该方式的复性率只有10％左右，采用这条工艺生产的胰岛素成本太高。第二种也是目前仍然是诸多公司生产重组人胰岛素的主要方式。通常采用融合蛋白的形式，将人胰岛素原接在一个较大的N-端融合蛋白后面，大大增加了胰岛素原的表达量(10％-30％)(Castellanos-Serra,etal.1996；Tikhonov,etal.2001)，表达产物通过溴化氰释放出人胰岛素原。由于C肽的存在，胰岛素原能形成良好的空间构象，折叠率达到70％，从而在一定程度上降低了胰岛素的生产成本。第三种方式是丹麦诺和诺德公司采用的A、B链同时表达的方法，在A链前端和A、B链中间均有甲硫氨酸。表达产物经溴化氰处理，得到A链和B链，再经过复性和纯化得到有活性的重组人胰岛素，这种方式与第一种方式存在着同样的因为复性效率带来的成本问题。综上所示，重组人胰岛素的制备工艺中，普遍存在的问题是生产过程复杂，包涵体表达复性率低造成生产成本高。本专利技术将重组人胰岛素原与SUMO标签融合，在大肠杆菌中以可溶形式表达，增加了胰岛素的表达量，纯化过程中不需要变复性工序，简化了纯化工艺、提高了胰岛素回收率、降低了生产成本。
技术实现思路
本专利技术解决的技术问题是提供了一种重组人胰岛素及其纯化制备方法，该重组人胰岛素由类泛素蛋白修饰分子SUMO标签和重组人胰岛素原融合而成，构建的重组融合蛋白具有可溶性表达、表达量高的特点。本专利技术为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种重组人胰岛素是类泛素蛋白修饰分子SUMO标签和重组人胰岛素原融合而成，重组人胰岛素原对应的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.2和SEQIDNO.4所示。重组胰岛素原编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.1和SEQIDNO.3所示。本专利技术所述的含有重组人胰岛素原融合蛋白编码基因的表达载体和表达载体的宿主细胞，表达载体为pET30a(+)，宿主细胞为Rossetta(DE3)。本专利技术重组人胰岛素的纯化制备方法，具体过程为：将编码重组人胰岛素原核苷酸序列与含有SUMO标签的表达载体相连接得到重组表达载体；再将该重组表达载体转化宿主细胞；筛选高表达阳性宿主细胞，培养细胞并诱导表达融合胰岛素原，收集菌体、破碎、离心、澄清、纯化得到重组人胰岛素蛋白。所述的重组人胰岛素纯化制备方法具体制备步骤为：(1)重组人胰岛素原基因表达载体的构建；通过DNA合成公司，合成具有SEQIDNO.1，SEQIDNO.2，SEQIDNO.3，SEQIDNO.4基因序列的重组人胰岛素原基因序列，将合成的重组人胰岛素原目的片段与原核表达载体pET30a(+)，该载体已连上SUMO基因连接，4℃连接过夜，经过酶切鉴定后，构建得到重组人胰岛素原基因表达载体pET-30a-SUMO-Insulin；(2)重组人胰岛素原融合蛋白的诱导表达；将步骤(1)构建得到重组人胰岛素原基因表达载体pET-30a-SUMO-Insulin转化表达到菌株Rosseta(DE3)上，转化后的单菌落分别接种至20mL含Amp(100ug/mL)的LB培养基中，37℃培养8-10h，以1:100接种于另一20mL含Amp(100μg/mL)的LB培养基中，37℃培养，当A600在0.3-0.4时，在温度为18-25℃、IPTG终浓度为0.1-1mmol/L、转速为40-120r/min的条件下诱导6-10h之后收集菌体；在此条件下进行表达重组融合蛋白SUMO-Insulin时，能够显著提高重组融合蛋白的表达水平。(3)重组人胰岛素类似物纯化分离得到重组人胰岛素；经过步骤(2)诱导表达得到的菌体，用lysisbuffer悬浮，超声破碎后离心或过滤，得菌体上清澄清液，上清澄清液采用Ni柱亲和层析获得SUMO-Insulin融合蛋白粗样，向获得的SUMO-Insulin融合蛋白粗样中加入胰蛋白酶酶切，酶切产物经一步或二步S或CM阳离子交换层析中度纯化，最后经一步或2步C8或C18高效液相色谱制备技术精纯获得纯度大于98％的重组人胰岛素。优选的，步骤(2)重组人胰岛素原融合蛋白的诱导表达中，筛选高表达阳性克隆菌进行大量培养并诱导表达得到菌体，通过中空纤维柱膜过滤技术对菌体进行富集，破碎，离心，上清液采用Ni亲和层析柱分离得到SUMO-Insulin融合蛋白粗样；将分离得到的SUMO-Insulin融合蛋白粗样中加入胰蛋白酶酶切，酶切产物经一步或2步S或CM阳离子交换层析中度纯化，最后经一步或2步C8或C18高效液相制备技术精纯获得纯度大于98％的重组人胰岛素蛋白。本专利技术与现有技术相比具有以下有益效果：本专利技术通过重组人胰岛素与SUMO标签融合表达提高了胰岛素表达量，实现胰岛素可溶表达，解决了包涵体复性率低的问题，降低胰岛素生产成本。附图说明图1是重组人胰岛素融合蛋白SUMO-Insulin诱导表达的SDS-PAGE电泳分析。图2是重组人胰岛素类似物纯化的Tricin-SDS-PAGE电泳分析。图3是纯化的重组人胰岛素类似物的HPLC分析。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。说明：本专利技术中涉及的基因的设计、合成和克隆、表达载体的构建、核酸提取、测序和鉴定，以及表达产物的分离和纯化等操作步骤，可按照本领域已知的技术进行(参见CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY)。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1重组人胰岛素原基因表达载体的构建通过DNA合成公本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组人胰岛素，其特征在于：所述重组人胰岛素是重组人胰岛素原与类泛素蛋白修饰分子SUMO标签融合可溶性表达，经纯化，分离得到；/n所述重组人胰岛素原对应的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示；/n所述重组人胰岛素原编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示；/n所述重组人胰岛素原与类泛素蛋白修饰分子SUMO标签融合表达在宿主细胞为可溶性表达，纯化过程中不需要复性操作。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组人胰岛素，其特征在于：所述重组人胰岛素是重组人胰岛素原与类泛素蛋白修饰分子SUMO标签融合可溶性表达，经纯化，分离得到；
所述重组人胰岛素原对应的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.2和SEQIDNO.4所示；
所述重组人胰岛素原编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.1和SEQIDNO.3所示；
所述重组人胰岛素原与类泛素蛋白修饰分子SUMO标签融合表达在宿主细胞为可溶性表达，纯化过程中不需要复性操作。


2.按照权利要求1所述的重组人胰岛素，其特征在于：所述重组人胰岛素原编码基因的表达载体为pET30a(+)，表达载体的宿主细胞为Rossetta(DE3)。


3.一种权利要求1所述的重组人胰岛素的纯化制备方法，其特征在于：所述重组人胰岛素是重组人胰岛素原与类泛素蛋白修饰分子SUMO标签融合可溶性表达，经纯化，分离得到；具体为：
通过重组人胰岛素原基因表达载体的构建，将编码重组人胰岛素原核苷酸序列与含有类泛素蛋白修饰分子SUMO标签的表达载体相连接得到重组表达载体；再将该重组表达载体转化宿主细胞；筛选高表达阳性宿主细胞，培养细胞并诱导表达融合胰岛素原，收集菌体、破碎、离心、澄清、纯化得到重组人胰岛素。


4.根据权利要求3所述的重组人胰岛素纯化制备方法，其特征在于：所述的重组人胰岛素纯化制备方法具体制备步骤为：
(1)重组人胰岛素原基因表达载体的构建；
通过DNA合成公司，合成具有SEQIDNO.1，SEQIDNO.2，SEQIDNO.3，SEQIDNO.4基因序列的重组人胰岛素原基因序列，将合成的重组人胰岛素原目的片段与原核表达载体pET30a(+)，该载体已连上SUMO基因连接，4℃连接过夜，经过酶切鉴定后，构建得到重组人胰岛素原基因表达载体pET-30a-SUMO-Insulin；
(2)重组人胰岛素原融合蛋白的诱导表达；
将步骤(1)构建得到重组人胰岛素原基因表达载体pET-30a-SUMO-Insulin转化表达到菌株Rosseta(DE3)上，转化后的单菌落分别接种至20mL含氨苄青霉素(Amp)(100ug/mL)的LB培养基中，37℃培养8-10h，以1:100接种于另一20mL含Amp(100μg/mL)的LB培养基中，37℃培养，当A600在0.3-0.4时，在温度为18-25℃、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)终浓度为0.1-1mmol/L、转速为40-120r/min的条件下诱导6-10h之后收集菌体；
(3)重组人胰岛素类似物纯化分离得到重组人胰岛素；
经过步骤(2)诱导表达得到的菌体，用lysisbuffer重悬，超声破碎后离心或过滤，得菌体上清澄清液，上清澄清液采用...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁鑫淼，叶贤龙，郭志谋，于伟，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21