靶向钙调蛋白磷酸酶与其底物T细胞激活核因子的短肽抑制剂及其应用制造技术

本发明专利技术公开了靶向钙调蛋白磷酸酶与其底物T细胞激活核因子的短肽抑制剂及其应用。本发明专利技术提供了融合多肽，为由钙调蛋白磷酸酶调节因子1的EV基序和T细胞激活核因子1的LxVP基序通过A238L连接肽连接而成，或者在其氨基端和/或羧基端连接上穿膜肽后所得。本发明专利技术所构建的pep3短肽，与CN结合和对酶活性抑制都表现出较强的能力，并在胞内的CN/NFAT信号通路中发挥着免疫抑制作用，能够比传统抑制剂环保菌素A更特异地破坏CN/NFAT相互作用，且在动物水平具有免疫抑制功能，可以作为用于局部免疫抑制进行开发或用于开发其它免疫抑制的工具药。

【技术实现步骤摘要】
靶向钙调蛋白磷酸酶与其底物T细胞激活核因子的短肽抑制剂及其应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及靶向钙调蛋白磷酸酶与其底物T细胞激活核因子的短肽抑制剂及其应用。
技术介绍
钙调蛋白磷酸酶(calcineurin,CN)是依赖于Ca2+和钙调素(calmodulin，CaM)的丝/苏氨酸蛋白磷酸酶，在生物体内能与底物和靶蛋白相互作用。CN是一个异源二聚体，由催化亚基(catalyticsubunit，Asubunit，CNA)和调节亚基(regulatorysubunit，Bsubunit，CNB)组成。两个亚基紧密结合，只有变性能使其分离。只有CNA存在时，其活性非常低，只有在CNB同时存在时，才能表现出高特异性的磷酸酶活性。当Ca2+结合到CNB时，对CN的活性具有重要的影响，但更为主要的影响是由于CaM的调节。T细胞激活核因子(nuclearfactorofactivatedT-cells,NFAT)是CN的重要底物之一，它的激活依赖于CN对其脱磷酸化作用，CN/NFAT信号通路参与了体内的免疫反应、神经系统发育、学习和记忆形成等重要的生理和病理过程。NFAT有两个与CN结合的基序(motif)，即PxIxITmotif和LxVPmotif。经典的免疫抑制药物环孢菌素A(cyclosporineA，CsA)就是通过与NFAT的LxVPmotif竞争，破坏CN/NFAT相互作用，起到免疫抑制作用。典型的免疫抑制剂环孢菌素A(cyclosporinA)需要和胞内环孢亲和素Cyclophilin结合，才能发挥抑制CN的脱磷酸化作用。其存在很多难以解决的毒副作用，主要不良反应为肾毒性、神经毒性、肝毒性，可能导致移植肾和正常肾出现长期的衰竭。它还能加重高血压、高血脂，因此会引起心血管系统的病变，也会增加肥胖的风险。钙调蛋白磷酸酶调节因子(regulatorsofcalcineurin，RCANs)是CN的内源性调节蛋白，通过影响CN的活性，来调控体内CN/NFAT信号通路，它与CN的结合也是依赖于其PxIxITmotif和LxVPmotif完成。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种靶向钙调蛋白磷酸酶与其底物T细胞激活核因子的短肽抑制剂及其应用。第一方面，本专利技术要求保护一种融合多肽。本专利技术所要求保护的融合多肽为如下(A1)或(A2)：(A1)融合多肽1，由钙调蛋白磷酸酶调节因子1(RCAN1)的EV基序(EVmotif)和T细胞激活核因子1(NFATc1)的LxVP基序(LxVPmotif)通过A238L连接肽连接而成；(A2)融合多肽2，为在(A1)所述融合多肽1的氨基端和/或羧基端连接上穿膜肽后所得。其中，所述钙调蛋白磷酸酶调节因子1的EV基序为SEQIDNo.1所示多肽。所述T细胞激活核因子1的LxVP基序为SEQIDNo.2所示多肽。所述A238L连接肽为SEQIDNo.3所示多肽。所述穿膜肽为SEQIDNo.5的第1-14位所示多肽。进一步地，所述融合多肽1为SEQIDNo.4所示多肽(命名为pep3)。所述融合多肽2为SEQIDNo.5所示多肽(命名为11R-pep3)。第二方面，本专利技术要求保护一种融合多肽修饰物。本专利技术所要求保护的融合多肽修饰物为第一方面中所述融合多肽的氨基端和/或羧基端进行荧光标记后所得。其中，所述荧光标记可为任何能够对多肽进行标记的荧光标记。在本专利技术的具体实施方式中，所述融合多肽修饰物具体为如下任一：(B1)所述融合多肽1的氨基端经FAM或FITC荧光标记；(B2)所述融合多肽2的氨基端经FITC荧光标记。第三方面，本专利技术要求保护编码前文所述融合多肽的核酸分子。进一步地，在所述核酸分子中，编码所述钙调蛋白磷酸酶调节因子1的EV基序的核酸分子为SEQIDNo.7所示DNA分子。编码所述T细胞激活核因子1的LxVP基序的核酸分子为SEQIDNo.8所示DNA分子。编码所述A238L连接肽的核酸分子为SEQIDNo.9所示DNA分子。更进一步地，编码所述融合多肽1的核酸分子为SEQIDNo.10所示的DNA分子。第四方面，本专利技术要求保护含有所述核酸分子的重组载体、表达盒、重组菌或转基因细胞系。其中，所述表达盒自上游到下游依次含有启动子、所述核酸分子(编码基因)以及终止序列。所述重组载体可为含有所述表达盒的重组载体。所述重组菌可为向受体菌中导入所述重组载体后所得。所述转基因细胞系可为向受体细胞中导入所述重组载体后所得。第五方面，本专利技术要求保护如下任一应用：(C1)前文所述融合多肽或所述融合多肽修饰物或所述核酸分子或所述重组载体或所述表达盒或所述重组菌或所述转基因细胞系在制备免疫抑制剂中的应用；(C2)前文所述融合多肽或所述融合多肽修饰物或所述核酸分子或所述重组载体或所述表达盒或所述重组菌或所述转基因细胞系在制备用于预防和/或治疗超敏反应性疾病的产品中的应用；(C3)前文所述融合多肽或所述融合多肽修饰物或所述核酸分子或所述重组载体或所述表达盒或所述重组菌或所述转基因细胞系在制备用于预防和/或治疗自身免疫性疾病的产品中的应用；(C4)前文所述融合多肽或所述融合多肽修饰物或所述核酸分子或所述重组载体或所述表达盒或所述重组菌或所述转基因细胞系在制备用于预防和/或治疗过敏反应的产品中的应用；(C5)前文所述融合多肽或所述融合多肽修饰物或所述核酸分子或所述重组载体或所述表达盒或所述重组菌或所述转基因细胞系在制备用于预防和/或治疗哮喘的产品中的应用；(C6)权利要求1-3中任一所述融合多肽修饰物或权利要求4所述融合多肽修饰物或权利要求5-7中任一所述的核酸分子或权利要求8所述的重组载体、表达盒、重组菌或转基因细胞系在制备用于抑制器官移植过程中机体免疫排斥的产品中的应用。第六方面，本专利技术要求保护前文所述融合多肽或所述融合多肽修饰物或所述核酸分子或所述重组载体或所述表达盒或所述重组菌或所述转基因细胞系在制备具有如下功能中至少一种的产品中的应用：(D1)与钙调蛋白磷酸酶(calcineurin,CN)结合；(D2)抑制钙调蛋白磷酸酶对底物的去磷酸化；进一步地，所述底物为RII肽；更进一步地，所述RII肽为SEQIDNo.6所示多肽；(D3)抑制离子霉素(Ionomycin)激活的T细胞激活核因子(NFAT)的入核行为；(D4)抑制钙调蛋白磷酸酶对T细胞激活核因子的去磷酸化；(D5)抑制受T细胞激活核因子启动的下游基因的表达；进一步地，所述下游基因为IL-2和/或TNF-α。所述表达可为转录水平的表达，也可以为蛋白水平的表达。本专利技术所构建的pep3短肽，相对于CsA而言，能够同时将CN和NFAT结合的两个作用位点占据，对CN结合能力和和对酶活性抑制都表现出较强的活性，并在胞内的CN/NFAT信号通路中发挥着免疫抑制作用，能够比传统抑制剂环保本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.融合多肽，为如下(A1)或(A2)：/n(A1)融合多肽1，由钙调蛋白磷酸酶调节因子1的EV基序和T细胞激活核因子1的LxVP基序通过A238L连接肽连接而成；/n(A2)融合多肽2，为在(A1)所述融合多肽1的氨基酸和/或羧基端连接上穿膜肽后所得。/n

【技术特征摘要】
1.融合多肽，为如下(A1)或(A2)：
(A1)融合多肽1，由钙调蛋白磷酸酶调节因子1的EV基序和T细胞激活核因子1的LxVP基序通过A238L连接肽连接而成；
(A2)融合多肽2，为在(A1)所述融合多肽1的氨基酸和/或羧基端连接上穿膜肽后所得。


2.根据权利要求1所述的融合多肽，其特征在于：所述钙调蛋白磷酸酶调节因子1的EV基序为SEQIDNo.1所示多肽；
和/或
所述T细胞激活核因子1的LxVP基序为SEQIDNo.2所示多肽；
和/或
所述A238L连接肽为SEQIDNo.3所示多肽；
和/或
所述穿膜肽为SEQIDNo.5的第1-14位所示多肽。


3.根据权利要求1或2所述的融合多肽，其特征在于：所述融合多肽1为SEQIDNo.4所示多肽；
和/或
所述融合多肽2为SEQIDNo.5所示多肽。


4.融合多肽修饰物，其特征在于：所述融合多肽修饰物为对权利要求1所述融合多肽的氨基酸和/或羧基端进行荧光标记后所得。


5.编码权利要求1-3中任一所述融合多肽的核酸分子。


6.根据权利要求5所述的核酸分子，其特征在于：在所述核酸分子中，编码所述钙调蛋白磷酸酶调节因子1的EV基序的核酸分子为SEQIDNo.7所示DNA分子；
和/或
在所述核酸分子中，编码所述T细胞激活核因子1的LxVP基序的核酸分子为SEQIDNo.8所示DNA分子；
和/或
在所述核酸分子中，编码所述A238L连接肽的核酸分子为SEQIDNo.9所示DNA分子。


7.根据权利要求5或6所述的核酸分子，其特征在于：编码所述融合多肽1的核酸分子为SEQIDNo.10所示的DNA分子。


8.含有权利要求5-7中任一所述核酸分子的重组载体、表达盒、重组菌或转基因细胞系。


9.如下任一应用：
(C1)权利要求1-3中任一所述融合多肽修饰物或权利要求4所述融合多肽修饰物或权利要求5-7中任一所述的核酸分子或权利要求8所...

【专利技术属性】
技术研发人员：骆静，王璐，王萍，程娜，魏群，
申请(专利权)人：北京师范大学，
类型：发明
国别省市：北京;11