一种猪伪狂犬病毒的gB亚单位重组蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种猪伪狂犬病毒的gB亚单位重组蛋白及其制备方法和应用，所述的制备方法包括1)将优化后的gB基因序列克隆到真核表达载体中，得到含有伪狂犬病毒的gB亚单位蛋白编码基因的重组质粒；2)再将所述含有伪狂犬病毒的gB亚单位蛋白编码基因的重组质粒转染至表达细胞中；3)通过培养、筛选、驯化步骤2)中所述表达细胞，得到高度表达的细胞株；4)发酵培养步骤3)中所述细胞株，纯化后，得到伪狂犬病毒的gB亚单位蛋白。本发明专利技术能够提供一种可大规模工业化生产的猪伪狂犬病毒gB亚单位蛋白且制备方法简单、成本低、产量远远大于已有杆状病毒表达系统。

【技术实现步骤摘要】
一种猪伪狂犬病毒的gB亚单位重组蛋白及其制备方法和应用
本专利技术属于生物技术基因重组表达领域。涉及一种猪伪狂犬病毒的gB亚单位重组蛋白及其制备方法和应用。
技术介绍
猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus,PrV)引起的造成母猪流产，新生仔猪中枢神经系统紊乱、断奶仔猪出现呼吸道症状并死亡的急性传染病，给养猪业带来了巨大的经济损失。目前，防控该病的主要措施是接种疫苗。亚单位疫苗以不含核酸，产生的免疫应答可以与野毒株相区分，接种后不会造成持续感染或潜伏感染，安全性较好。然而。目前亚单位疫苗由于蛋白生产成本高，其应用受到了限制。PRV属疱疹病毒科，病毒呈球形，有囊膜和纤突。病毒表面已鉴定了11种糖蛋白：gB(gII)、gC(gIII)、gD(gp50)、gE、gG、gH、gI、gK、gL、gM和gN。其中，gB糖蛋白是由UL27所编码，又被称为gII糖蛋白，由gIIa、gIIb和gIIc三个蛋白组成，其中gIIb和gIIc是有gIIa水解得到的。研究发现gB蛋白是伪狂犬病毒的一种重要的中和蛋白，能促进细胞外膜和病毒囊膜的融合。因此，gB蛋白是很好的保护性抗原，利用gB蛋白制备亚单位疫苗能够抵御伪狂犬病毒强毒的攻击。gB是一种糖基化蛋白，为了更好的保持其结构稳定性和免疫原性。需要使用真核系统表达该蛋白。专利CN105693827A一种猪伪狂犬病毒亚单位疫苗及其制备方法和应用。该方法利用杆状病毒系统成功表达了伪狂犬病毒gB蛋白，为生产gB亚单位疫苗提供了方法。但其产量仅有6mg/L。对于应用于兽用疫苗上，产量还是相对较低。此外，昆虫细胞杆状病毒表达的糖基化蛋白修饰一般仅具有高甘露型糖链或寡甘露糖链，糖链末端极少带有半乳糖、唾液酸等残基，与高等生物糖基化修饰方式和程度不同。只有在哺乳动物细胞中表达，其糖蛋白的结构及生理生化特征才更接近于天然状态。因此，研制一种生产成本低，生产产量高、蛋白质结构更接近于天然的gB蛋白的生产方法对伪狂犬亚单位疫苗、开发诊断试剂盒等应用具有重要的现实意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种可大规模工业化生产的重组的猪伪狂犬病毒表面的gB亚单位蛋白。为了解决该问题，一方面本专利技术人在充分分析、研究目前所能得到的猪伪狂犬病毒的资料的基础上，通过结构分析gB蛋白的整体结构，将gB蛋白中不具有保护性抗原的的跨膜区和胞内区去除，得到一种结构稳定的猪伪狂犬病毒的gB亚单位重组蛋白，所述gB亚单位重组蛋白为gB蛋白的胞外区，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。根据本专利技术的技术方案，优选地，所述gB亚单位重组蛋白编码的基因序列如SEQIDNO.2所示。根据本专利技术的技术方案，优选地，所述gB亚单位重组蛋白编码的基因序列能够在CHO细胞中高效分泌表达gB亚单位蛋白的优化的gB基因序列，所述优化后的gB基因序列如SEQIDNO.1所示。根据本专利技术的技术方案，优选地，所述gB亚单位重组蛋白在如SEQIDNO.3所示的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端可连接有检测或纯化标签，其中，所述标签选自ploy-Arg、ploy-His、FLAG、c-myc、HA中的一种。这里，为了使所述亚单位gB蛋白便于检测或纯化，本领域的技术人员通过常规的技术手段，可在如SEQIDNO.3所示的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端连接如表一所示的标签，本实施例中具体以Poly-His为例，将其连接于如SEQIDNO.3所示的氨基酸序列的羧基末端处。表一标签及其氨基酸序列根据本专利技术的技术方案，优选地，所述猪伪狂犬病毒亚单位蛋白包括在如SEQIDNO3所示中的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有免疫原性的衍生的蛋白质。根据本专利技术的技术方案，优选地，所述猪伪狂犬病毒gB的氨基酸来自于包括猪伪狂犬病毒bartha株、HeN1株、NVDC-PRV-BJ株、PRV-TJ株、Fa株、Becker株；猪伪狂犬病毒变异株PRV-ZJ01、HN1201、HN1202株等。猪伪狂犬病毒gB亚单位蛋白是疱疹病毒成员中属于最保守的糖蛋白。根据本专利技术的技术方案，优选地，所述猪伪狂犬病毒亚单位gB蛋白的表达系统为哺乳动物细胞。根据本专利技术的技术方案，优选地，所述哺乳动物细胞为CHO细胞。根据本专利技术的另一方面，本专利技术提供了一种制备猪伪狂犬病毒gB蛋白的方法，包括：1)将如SEQIDNO.1所示的优化后的gB基因序列克隆到真核表达载体中，得到含有伪狂犬病毒的gB亚单位蛋白编码基因的重组质粒；2)再将所述含有伪狂犬病毒的gB亚单位蛋白编码基因的重组质粒转染至表达细胞中；3)通过培养、筛选、驯化步骤2)中所述表达细胞，得到高度表达的细胞株；4)发酵培养步骤3)中所述细胞株，纯化后，得到伪狂犬病毒的gB亚单位蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。本专利技术的技术方案中，优选地，步骤1)中，所述真核表达载体可以为pEE6.4、pEE12.4、pGL4.13、pcDNA3.1；优选地，所述真核表达载体为pEE12.4或pcDNA3.1。本专利技术的技术方案中，优选地，步骤2)中，所述表达细胞为哺乳动物细胞。本专利技术的技术方案中，优选地，所述哺乳动物细胞为CHO细胞或293T细胞。本专利技术的技术方案中，优选地，所述CHO细胞包括DG44、DXB11、CHO-K1、CHO-S细胞株，优选地，所述CHO细胞为CHO-K1细胞。根据本专利技术的再一方面，本专利技术提供了一种猪伪狂犬病毒的gB亚单位重组蛋白在制备用于诊断、预防和治疗猪伪狂犬的疫苗中的应用。本专利技术构建并筛选了悬浮稳定高效分泌表达伪狂狂犬病毒gB蛋白的CHO细胞株，该细胞株表达伪狂狂犬病毒gB蛋白产量高(产量高达0.8-1.2g/L)、远高于现有表达技术，且易于纯化(如图4所示，只需一步亲和层析就能使目的蛋白纯度达到90％以上，远远满足亚单位疫苗和诊断试剂的需求)、易于大规模生产。因此，解决了伪狂犬病毒gB亚单位疫苗存在的一个缺陷，即蛋白生产成本高的问题。另外，由于生产用的CHO细胞株在培养时可控制性高、质控容易、生产蛋白批次间稳定，生物安全高(没有病毒，不存在散毒的风险)。附图说明图1表示gB基因序列优化前后比对结果。图2表示pEE12.4-OPTI-gB质粒图谱。图3表示pEE12.4-OPTI-gB双酶切鉴定结果：M是DNAMarker：DL10000Marker；1是pEE12.4-OPTI-gB双酶切电泳结果，酶切大小分别为条带大小分别为8746bp，2172bp。图4表示重组gB的SDS-PAGE纯化检测结果：1是蛋白Marker，2是纯化后的糖基化后的gB蛋白，分子量大约130Kd(上样缓冲液中不含β-巯基乙醇等还原剂)。图5表示重组gB蛋白的West-blot检测结果：1是maker，2是纯化后的gB蛋白，western结果显示条带大约位于130Kd，其大小和SDS-PAGE大小一致。具体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪伪狂犬病毒的gB亚单位重组蛋白，其特征在于，所述gB亚单位重组蛋白为gB蛋白的胞外区，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种猪伪狂犬病毒的gB亚单位重组蛋白，其特征在于，所述gB亚单位重组蛋白为gB蛋白的胞外区，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。


2.根据权利要求1所述的猪伪狂犬病毒gB亚单位重组蛋白，其特征在于，所述gB亚单位重组蛋白编码的基因序列如SEQIDNO.2所示。


3.根据权利要求1所述的gB亚单位重组蛋白，其特征在于，所述gB亚单位重组蛋白编码的基因序列能够在CHO细胞中高效分泌表达gB亚单位蛋白的优化的gB基因序列，所述优化后的gB基因序列如SEQIDNO.1所示。


4.根据权利要求1所述的gB亚单位重组蛋白，其特征在于，所述gB亚单位重组蛋白在如SEQIDNO.3所示的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端可连接有检测或纯化标签，其中，所述标签选自ploy-Arg、ploy-His、FLAG、c-myc、HA中的一种。


5.一种如权利要求1～4任一所述的猪伪狂犬病毒的gB亚单位重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1)将如SEQIDNO.1所示的优化后的gB基因序...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱泓，吴有强，卞广林，张强，徐玉兰，吴素芳，黄丽嫒，姜冰洁，蔡灵芝，贾宝琴，
申请(专利权)人：浙江海隆生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33