一种用于甲基化扩增子测序的建库方法技术

本发明专利技术公开了一种用于甲基化扩增子测序的建库方法，涉及分子生物学技术领域，所述建库方法包括以下步骤：1)第一次PCR扩增；2)一次磁珠纯化；3)补平修复；4)接头连接；5)二次磁珠纯化；6)第二次PCR扩增；7)三次磁珠纯化。为了解决传统靶向甲基化测序中的测序文库的构建费用过高和周期过长的问题，本发明专利技术通过利用特异性引物对重亚硫酸盐转化过后的DNA进行多重PCR反应得到靶向的扩增子，然后利用连接反应将NGS测序用到的接头加至扩增子两端纯化回收形成测序文库，有利于实现靶向甲基化测序，减低了测序文库的构建费用和周期，具有广阔的市场前景。

【技术实现步骤摘要】
一种用于甲基化扩增子测序的建库方法
本专利技术涉及分子生物学
，具体是一种用于甲基化扩增子测序的建库方法。
技术介绍
随着高通量测序技术的发展，测序成本的降低，使测序技术逐渐成为基础生物学研究和医学检测的常规实验方法。DNA甲基化是一种人体内常见的表观遗传学修饰方式，其可以调控被修饰基因的表达情况，因此与肿瘤的发生有密切关系。通过检测肿瘤相关基因的甲基化状态可完成对肿瘤的早期筛查、辅助诊断、治疗以及预后。目前对DNA甲基化状态的检测主要是基于亚硫酸盐预处理，从而将DNA样本中的未被甲基化的胞嘧啶(C)转化为尿嘧啶(U)，而被甲基化的胞嘧啶(C)则无法被转化而保持原始状态，随后通过二代基因测序(Nextgenerationsequencing，NGS)技术对其甲基化状态进行检测。NGS技术通过全基因组的甲基化测序已经构建了大量常规物种的甲基化图谱，因此促进了人类表观遗传学，特别是DNA甲基化与人类肿瘤之间相关性的研究。但是，全基因组甲基化测序流程复杂，需求数据量大，周期长，费用高；同时，当前许多研究者仅对基因组中部分基因的特定区域甲基化状态感兴趣，因而只需对相应的靶向区域进行测序即可。扩增子测序(AmpliconSequencing)就是一种可以只对目标区域进行测序研究的靶向基因测序技术。这种方法已经在常规的基因测序中得到了有效的验证，而在靶向甲基化测序方面，Padlock甲基化靶向测序技术已被证实可以进行相关的文库构建与测序，但其文库构建过程过于繁琐，并且耗时过长；CpGiant甲基化捕获技术也已经被证明可以用来进行靶向甲基化测序，但是CpGiant检测成本过于高昂，因而无法在普通实验室进行普及应用。因此，需要提供一种用于甲基化扩增子测序的建库方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于甲基化扩增子测序的建库方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。通过提供一种适用于甲基化扩增子测序的建库方法，从而建立起甲基化扩增子测序的操作过程，使其可以应用到基因组中特定区域的甲基化状态检测，实现靶向甲基化测序，并且在不影响测序质量的情况下，减低测序文库的构建费用和周期。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种用于甲基化扩增子测序的建库方法，其特征在于，它包括以下步骤：1)第一次PCR扩增：利用甲基化特异性扩增子引物，对重亚硫酸盐转化过后的基因组DNA按照常规方法进行第一次PCR扩增，得到第一次PCR产物，完成对靶向区域的扩增和富集；2)一次磁珠纯化：对步骤1)中得到的第一次PCR产物进行磁珠纯化并且回收，得到第一次PCR回收产物；通过采用磁珠纯化比一般的过柱纯化速度快，可节省实验时间；3)补平修复：将步骤2)中得到的第一次PCR回收产物末端补平修复加A，得扩增子；4)接头连接：利用连接反应，将NGS测序用到的接头加至步骤3)中得到的扩增子两端，得连接产物；5)二次磁珠纯化：对步骤4)中得到的连接产物进行磁珠纯化并回收得扩增子连接产物；6)第二次PCR扩增：按照常规方法对步骤5)中回收的混合物进行第二次PCR扩增，从而将P5、P7序列加至文库两端,得到第二次PCR产物；7)三次磁珠纯化：对步骤6)中得到的第二次PCR产物进行磁珠纯化并且回收，形成最终测序前的文库。作为本专利技术进一步的方案：步骤1)中，在针对靶向区域进行引物设计时控制引物长度在20-25bp之内，同时引物内部不包含CpG位点。作为本专利技术再进一步的方案：步骤1)中，所述第一次PCR扩增的退火温度在55℃-65℃。作为本专利技术再进一步的方案：步骤1)中，所述DNA为待测样品的基因组DNA进行提取而得。作为本专利技术再进一步的方案：所述提取采用本领域内常规方法进行，例如使用Omega公司的SOILDNAKIT进行提取。作为本专利技术再进一步的方案：步骤6)中，所述第二次PCR扩增的正向引物中带有P5序列，反向引物带有P7序列。所述的用于甲基化扩增子测序的建库方法在甲基化测序中的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：1)本专利技术利用不依赖甲基化状态的捕获引物，对重亚硫酸盐转化过后的基因组DNA进行多重PCR反应，从而得到靶向的扩增子，然后利用连接反应，将NGS测序用到的接头加止扩增子两端，纯化回收后，通过PCR反应将P5、P7序列加止文库两端，形成最终测序前的文库，解决了传统靶向甲基化测序中的测序文库的构建费用过高和周期过长的问题；2)本专利技术提供了一种适用于甲基化扩增子测序的建库方法，从而建立起甲基化扩增子测序的操作过程，使其可以应用到基因组中特定区域的甲基化状态检测，实现靶向甲基化测序，并且在不影响测序质量的情况下，减低测序文库的构建费用和周期；3)本专利技术可以对基因组上特定区域甲基化状态进行检测，由于采用了PCR过程进行靶向序列的富集，因而相比较依赖探针进行靶向富集的padlock和CpGiant方法，该专利技术大幅度降低了文库构建的成本；此外，由于本专利技术不涉及到DNA杂交的过程，因此在文库构建时间上大幅度改善，由padlock和CpGiant的3-4天降至1天。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术的技术方案作进一步详细地说明。实施例1一种用于甲基化扩增子测序的建库方法，其特征在于，它包括以下步骤：1)第一次PCR扩增：利用甲基化特异性扩增子引物，对重亚硫酸盐转化过后的基因组DNA进行第一次PCR扩增，得到第一次PCR产物，完成对靶向区域的扩增和富集；其中，在针对靶向区域进行引物设计时控制引物长度为20bp，同时引物内部不包含CpG位点；所述第一次PCR扩增的退火温度在55℃；所述基因组DNA为将待测样品的基因组DNA进行提取而得，所述提取采用本领域内常规方法进行，本实施例中，使用Omega公司的SOILDNAKIT进行提取；2)一次磁珠纯化：对步骤1)中得到的第一次PCR产物进行磁珠纯化并且回收，得到第一次PCR回收产物；通过采用磁珠纯化比一般的过柱纯化速度快，可节省实验时间；3)补平修复：将步骤2)中得到的第一次PCR回收产物末端补平修复加A，得扩增子；4)接头连接：利用连接反应，将NGS测序用到的接头加至步骤3)中得到的扩增子两端，得连接产物；5)二次磁珠纯化：对步骤4)中得到的连接产物进行磁珠纯化并回收得混合物；6)第二次PCR扩增：按照常规方法对步骤5)中回收的混合物进行第二次PCR扩增，得到第二次PCR产物；所述第二次PCR扩增的正向引物中带有P5序列，反向引物带有P7序列；7)三次磁珠纯化：对步骤6)中得到的第二次PCR产物进行磁珠纯化并且回收，形成最终测序前的文库。本实施例中，所述的用于甲基化扩增子测序的建库方法在甲基化测序中的应用。实施例2一种用于甲基化扩增子测序的建库方法，其特征在于，它包括以下步骤：1)第一次PCR扩增：利用甲基化特异性扩增子引物，对本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于甲基化扩增子测序的建库方法，其特征在于，它包括以下步骤：/n1)第一次PCR扩增：利用不依赖甲基化状态的扩增子引物，对重亚硫酸盐转化过后的DNA进行第一次PCR扩增，得到第一次PCR产物，完成对靶向区域的扩增和富集；/n2)一次磁珠纯化：对步骤1)中得到的第一次PCR产物进行磁珠纯化并且回收，得到第一次PCR回收产物；/n3)补平修复：将步骤2)中得到的第一次PCR回收产物末端补平修复加A，得扩增子；/n4)接头连接：利用连接反应，将NGS测序用到的接头加至步骤3)中得到的扩增子两端，得连接产物；/n5)二次磁珠纯化：对步骤4)中得到的连接产物进行磁珠纯化并回收扩增子连接产物；/n6)第二次PCR扩增：按照常规方法对步骤5)中回收的扩增子连接产物进行第二次PCR扩增，从而将P5、P7序列加至文库两端,得到第二次PCR产物；/n7)三次磁珠纯化：对步骤6)中得到的第二次PCR产物进行磁珠纯化并且回收，形成最终测序前的文库。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于甲基化扩增子测序的建库方法，其特征在于，它包括以下步骤：
1)第一次PCR扩增：利用不依赖甲基化状态的扩增子引物，对重亚硫酸盐转化过后的DNA进行第一次PCR扩增，得到第一次PCR产物，完成对靶向区域的扩增和富集；
2)一次磁珠纯化：对步骤1)中得到的第一次PCR产物进行磁珠纯化并且回收，得到第一次PCR回收产物；
3)补平修复：将步骤2)中得到的第一次PCR回收产物末端补平修复加A，得扩增子；
4)接头连接：利用连接反应，将NGS测序用到的接头加至步骤3)中得到的扩增子两端，得连接产物；
5)二次磁珠纯化：对步骤4)中得到的连接产物进行磁珠纯化并回收扩增子连接产物；
6)第二次PCR扩增：按照常规方法对步骤5)中回收的扩增子连接产物进行第二次PCR扩增，从而将P5、P7序列加至文库两端,得到第二次PCR产物；
7)三次磁珠纯化：对步骤6)中得到的第二次PCR产物进行磁珠纯化并且回收，形成最终测序前的文库。

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【专利技术属性】
技术研发人员：王俊，李小花，刘朝煜，姚旭梅，
申请(专利权)人：深圳思凝一云科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44