一种肺肿瘤血浆游离DNA多位点突变检测的方法技术

本发明专利技术的一种肺肿瘤血浆游离DNA多位点突变检测的方法，其特征在于，采用特异性引物、特异性PNA探针及捕获技术来提高ctDNA检测和特异性，从而能够检测微量ctDNA，在肺部占位性病变患者外周血标本中基因变异检测的引物，探针，以及检测方法。该方法具有灵敏度高，特异性强，重复性好，操作简单，检测快速，安全等优点，对肺癌的诊断有辅助作用。对肺癌的诊断有辅助作用。对肺癌的诊断有辅助作用。

【技术实现步骤摘要】
一种肺肿瘤血浆游离DNA多位点突变检测的方法


[0001]本专利技术涉及DNA多位位点突变检测方法，特别是涉及离休肺瘤血浆中游离DNA多位点突变检测的方法。

技术介绍

[0002]伴随二代测序技术的发展，“液态活检”作为新型诊断技术，因其无创性、实时动态性等特征，近年来得到迅猛的发展，正成为肿瘤精准医疗领域的新热点。其中以血浆为代表的体液样本基因检测最受瞩目，该方法从外周血中获得游离核酸或细胞，寻找肿瘤信息，进而为早期诊断等提供依据。国内肺癌无论发病率还是致死率均为所有癌种之首，早诊早筛迫在眉睫。
[0003]目前精确测序ctDNA、实现肿瘤早期筛查存在的技术难点包括ctDNA的有效提取和识别、背景噪声的扣除、医学意义的判读等，而基因面板的选择对克服上述难点非常关键，合适的基因和位点能够起到标志物的作用，降低对ctDNA提取量的要求、降低背景噪声扣除的难度、提升结果判读的目的性和准确性，其对ctDNA检测结果起到决定性的作用。现有的ctDNA检测方法主要存在灵敏度低和特异性差的缺点。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供从临床外周血标本中检测循环肿瘤基因突变信号的方法。
[0005]本专利技术的一种肺肿瘤血浆游离DNA多位点突变检测的方法，通过采用特异性引物
[0006]Forward:
[0007]5’
AGGCGAAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC3
’
[0008]Reverse:
[0009]5’
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTCGCCT3
’
[0010]特异性RNA探针以及捕获技术，提高了ctDNA检测的灵敏度和特异性，从而能够检测微量(0.1％)的ctDNA。
[0011]b.本专利技术提供了特异性ctDNA检测所需的特异性引物，特异性探针，以及相应的ctDNA检测程序。
[0012]1，特异性基因集合(gene
‑
panel)
[0013]2，特异性DNA引物集合(primer
‑
panel)
[0014]3，特异性RNA探针集合(probe
‑
panel)
[0015]5’
GTTCTGGAAGATCTTGAACCCTCTTCTGGAAAGGGGTACCTATTATTACTTTATGGGGCAGCAGCCTGGAAAAGTACTTGGGGACCAAAGAAGGCCAAGCTTGCCTGCCCTGCATTTTAT3
’
[0016]5’
CAAAGGAGCAGGGAAGAAGGAATCATCGAGGCATGGGGGTCCACACTGCAATGTTTTTGTGGAACATGGTGAGTGCTTTTCAAAATTTCTGCTCATGGTTTTCCTCATGCATTCATCTTA3
’
[0017]5’
CCCGACGTGCTGGCGCGGGAAAATGTTGGAGATCTGCCTGAAGCTGGTGGGCTGCAAATCCAAGAAGGGGCTGTCCTCGTCCTCCAGCTGTTATCTGGAAGGTAAGCCCGGGCCGCACGG3
’
[0018]……
共3179条探针
[0019]该专利技术所述肺肿瘤血浆游离DNA多位点突变检测的方法，包括：
[0020]①
对正常白细胞gDNA、瘤旁正常细胞gDNA及从肺部肿瘤FFPE样本中提取的肿瘤细胞gDNA进行片段化、加接头、及PCR富集等步骤制备预文库；
[0021]②
采用具有特定序列的RNA探针与预文库进行杂交，从而特异性地捕获来自人类基因组的68种基因中的部分外显子与内含子区域；
[0022]③
通过磁珠法富集被探针捕获的DNA片段，并对捕获的文库进行定量、质控与序列测定；
[0023]④
采用生物信息学软件判读68种靶基因中是否存在来自肿瘤的变异；
[0024]⑤
对标准品ctDNA及从肺肿瘤血浆样本中提取的cfDNA加接头及PCR富集等步骤制备预文库；
[0025]⑥
采用具有特定序列的RNA探针与预文库进行杂交，从而特异性地捕获来自人类基因组的68种基因中的部分外显子与内含子区域；
[0026]⑦
通过磁珠法富集被探针捕获的DNA片段，并对捕获的文库进行定量、质控与序列测定；
[0027]⑧
采用生物信息学软件判读68种靶基因中是否存在来自肿瘤的变异。
[0028]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：。
[0029]本专利技术的两轮助力手推车。
[0030]有益效果：在肺部占位性病变患者外周血标本中基因变异检测的引物，探针，以及检测方法。本专利技术可在标准品ctDNA中实现突变频率0.1％的ctDNA检测，相较其他方法提高了检测的灵敏度和特异性，重复性好，操作简单，检测快速，安全等优点，对肺癌的诊断有辅助作用。
附图说明
[0031]图1为分子标签的分布均匀性示意图(以基因BRAF的序列分析为例展示)；
[0032]图2为突变频率为0.1％的ctDNA标准品(购自Horizon，含6个位点)检测示意图；
[0033]图3为在100例早期肺癌(I
‑
II期)临床外周血标本中获得了明显优异于肿瘤蛋白标志物的阳性检出率示意图。
具体实施方式
[0034]1.提取cfDNA以及WBC
‑
gDNA，WBC
‑
gDNA需要经超声打断至170bp左右；
[0035]2.加A尾，产物纯化后进行接头连接，纯化分选300bp以下的DNA片段，引入barcode；
[0036]3.分管PCR，反应条件同NEB multiplex PCR(NEB,M0284s)反应体系。95℃ 1min，60℃ 60s，68℃ 90s，4℃无限。2个循环以上；PCR产物纯化后，第二轮PCR，反应条件同NEB multiplex PCR，30个循环；
[0037]4.产物经凝胶电泳检测片段长度，理论产物约在200bp以下。
[0038]5.完成建库。
[0039]实验条件优化：
[0040]1.确保ligation效率
[0041]2.确保adapter处引入的随机分子标签barcode连上DNA模板(优化随机碱基的数量)。如图1所示
[0042]3.P5 primer(+)与P7
‑
targetgene
‑
3R以及P7
‑
targetgene
‑
3F存在竞争性关系，所以P5 primer(+)应较其他两种引物浓度高(比例需要优化)。
[0043]4.两轮PCR的循环数需要优化。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肺肿瘤血浆游离DNA多位点突变检测的方法，采用特异性引物、特异性RNA探针及捕获技术来提高ctDNA检测和特异性，从而能够检测微量ctDNA，具体步骤如下：
①
对正常白细胞gDNA、瘤旁正常细胞gDNA及从肺部肿瘤FFPE样本中提取的肿瘤细胞gDNA进行片段化、加接头、及PCR富集等步骤制备预文库；
②
采用具有特定序列的RNA探针与预文库进行杂交，从而特异性地捕获来自人类基因组的68种基因中的部分外显子与内含子区域；
③
通过磁珠法富集被探针捕获的DNA片段，并对捕获的文库进行定量、质控与序列测定；
④
采用生物信息学软件判读68种靶基因中是否存在来自肿瘤的变异；
⑤
对标准品ctDNA及从肺肿瘤血浆样本中提取的cfDNA加接头及PCR富集等步骤制备预文库；
⑥
采用具有特定序列的RNA探针与预文库进行杂交，从而特异性地捕获来自人类基因组的68种基因中的部分外显子与内含子区域；
⑦
通过磁珠法富集被探针捕获的DNA片段，并对捕获的文库进行定量、质控与序列测定；
⑧
采用生物信息学软件判读68种靶基因中是否存在来自肿瘤的变异。2.根据权利要求1所述肺肿瘤血浆游离DNA多位点突变检测的方法，其特征在于，所述特异性引物为：Forward:5
...

【专利技术属性】
技术研发人员：李小花，刘朝煜，姚旭梅，
申请(专利权)人：深圳思凝一云科技有限公司，
类型：发明
国别省市：