一种定量miRNA的测序文库制备和分析方法技术

为了解决miRNA的精确定量问题，本发明专利技术提供一种定量miRNA的测序文库制备和分析方法，其主要步骤包括在RNA两端连接衔接子RA5与RA3；使用反转录引物RT Primer获得DNA第一链并对溶液进行不同倍数的稀释；使用Primer1和Primer2进行PCR并对扩增产物中目的DNA片段进行切胶回收；使用Illumina测序平台进行测序；使用生物信息学工具分析下机数据并使用算法校正miRNA的表达量。本发明专利技术设计的包含随机标签序列的衔接子RA5能有效去除PCR扩增带来的重复序列，实现对miRNA进行更为精准的表达定量；本发明专利技术提出的稀释法以及对应的算法，有效避免了因miRNA的不同拷贝连接上同样的随机标签序列而造成表达量低估的情况，因此进一步提高了定量的准确性。

【技术实现步骤摘要】
一种定量miRNA的测序文库制备和分析方法
本专利技术涉及生物
，更具体地，涉及一种用于精确定量miRNA(英文全称为microRNA，中文名称为微小RNA)的高通量测序文库的制备和分析方法。
技术介绍
miRNA是一类平均长度仅为22个核苷酸的非编码RNA,在细胞内发挥重要的生物学功能。目前市场上用于miRNA高通量文库制备的主流试剂盒，如Illumina公司和NEB公司的miRNA建库试剂盒，构建的测序文库都难以实现精准定量，其结果往往和qPCR定量(qPCR的英文全名为Real-timeQuantitativePCRDetectingSystem，中文解释为实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统)结果有一定的差距。尽管SaifulIslam等人报道的针对单细胞测序的定量化标签方法(NatureMethods,2014,11:163-166)能大幅提高定量的准确性，但此法不适用于取自大量细胞的RNA样品的建库和定量分析。目前，有人提出在miRNA文库制备过程中加入随机标签序列以实现精确定量的效果。尽管此方法在整本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种定量miRNA的测序文库制备和分析方法，其包括如下步骤:/n(1)提供一种用于制备测序文库的RNA样品,总体积为5μl,总量为2μg以上；/n(2)提供一种用于连接步骤(1)中所述的RNA样品3’端的衔接子RA3，RA3的序列为5’-TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-3’；/n(3)提供一种用于连接步骤(1)中所述RNA样品5’端的衔接子RA5，衔接子RA5的序列包括固有结构S1-S2-S3，其中S1的碱基序列为5’-GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC-3’，S2是长度为11～15个的随机核苷酸序列N

【技术特征摘要】
1.一种定量miRNA的测序文库制备和分析方法，其包括如下步骤:
(1)提供一种用于制备测序文库的RNA样品,总体积为5μl,总量为2μg以上；
(2)提供一种用于连接步骤(1)中所述的RNA样品3’端的衔接子RA3，RA3的序列为5’-TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-3’；
(3)提供一种用于连接步骤(1)中所述RNA样品5’端的衔接子RA5，衔接子RA5的序列包括固有结构S1-S2-S3，其中S1的碱基序列为5’-GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC-3’，S2是长度为11～15个的随机核苷酸序列N11-15，S2定义为随机标签序列，S3是长度为4个的固定碱基，且S3选自ACGA、CCGA、CGAU、CGUA、CGUU、GACG、GCCA、GCGU、GGAA、GUCG、GUCU中的一种；
(4)取一定量步骤(1)所述的RNA样品与适量步骤(2)所述的衔接子RA3混合进行连接反应，从而形成核酸-衔接子RA3的复合物；
(5)将步骤(4)中获得的核酸-衔接子RA3的复合物与衔接子RA5进行连接反应，从而形成衔接子RA5-核酸-衔接子RA3的复合物；
(6)将步骤(5)获得的衔接子RA5-核酸-衔接子RA3的复合物与特异性结合于衔接子RA3的反转录引物RTPrimer混合，进行反转录反应，得到DNA第一链，其中反转录引物RTPrimer的序列为5’-CCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3’；
(7)从步骤(6)获得的含有DNA第一链的溶液中按照体积比例取出6份，使它们的体积分别占原溶液的1/2,1/5,1/10,1/20,1/50和1/100,随后用水分别稀释2倍、5倍、10倍、20倍、50倍和100倍至与原溶液相等体积,并将稀释后的含有DNA第一链的溶液依次标记为样品C、样品D、样品E、样品F、样品G和样品H；
(8)将步骤(7)获得的样品C、样品D、样品E、样品F、样品G和样品H分别与特异性结合于衔接子RA3相应区域的引物Primer1和特异性结合于衔接子RA5相应区域的引物Primer2进行混合,进行PCR反应,获得扩增产物；其中，Primer1的序列为5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTCGTGATGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3’，Primer2的序列为5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA-3’，其中标下划线的8个碱基“GTCGTGAT”为index序列(index序列的中文翻译为索引序列)，所述的index序列至少还可用以下十种index序列替换：ACCACTGT,TGGATCTG,CCGTTTGT,TGCTGGGT,GAGGGGTT,AGGTTGGG,GTGTGGTG,TGGTCACA,TTGACCCT,CCACTCCT；样品C-H中的每个样品选择使用一个index序列，且不同的样品使用的index序列各不相同，较为具体的，样品C-H选择的index序列包括但不限定于GTCGTGAT、ACCACTGT,TGGATCTG,CCGTTTGT,TGCTGGGT,GAGGGGTT,AGGTTGGG,GTGTGGTG,TGGTCACA,TTGACCCT,CCACTCCT；
(9)将步骤(8)获得的6份扩增产物进行6％聚丙烯酰胺凝胶电泳,胶块经染色后在紫外灯下识别各DNA条带,割取所需的目的DNA片段并回收,此即制备完成的测序文库,通过Agilent2100Bioanalyzer进行片段长度范围检测和InvitrogenQubit进行定量之后即可...

【专利技术属性】
技术研发人员：李华，沈益行，郭子文，谢跃华，
申请(专利权)人：苏州京脉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32