一种马铃薯黑胫病抗性的鉴定方法技术

本发明专利技术提供了一种马铃薯黑胫病抗性的鉴定方法，包括：选择有10片完全展开的叶片的马铃薯植株，并选取第4‑6片成熟健康叶的叶柄作为待测叶柄；将所述待测叶柄置于浓度为10

【技术实现步骤摘要】
一种马铃薯黑胫病抗性的鉴定方法
本专利技术涉及一种马铃薯病原菌抗性的鉴定方法，尤其涉及一种马铃薯黑胫病抗性的鉴定方法。
技术介绍
马铃薯黑胫病由果胶杆菌(Pectobacteriumspp.和Dickeyaspp.)引起的发生在马铃薯植株茎基部及块茎上的严重病害，该病害主要侵染维管束组织，从种薯发芽到生长后期均可发病，以苗期最盛。黑胫病菌可通过灌溉、雨水传播，也可通过昆虫为害造成的伤口侵染，还可以通过农业操作造成的机械伤口侵染，侵染后植株上产生典型的黑胫病症状。后期病株上的病菌在土壤传染薯快，使薯块带菌。在贮藏期间，病菌通过接触健康数块伤口而传染，并能在发病的块茎里存活。同时病菌在种薯块茎或收获过程中遗留在田间未完全腐烂的病薯上越冬，成为翌年的初侵染来源。所以，马铃薯黑胫病是世界马铃薯种植中的重要病害，近些年在我国发生越来越严重，威胁着马铃薯产业的健康发展。由于马铃薯中对抵抗黑胫病没有主效的抗病基因，只有一些可能的QTL(quantitativetraitlocus)发挥作用，所以，马铃薯田间一旦发黑胫病，很难得到控制，因此目前生产上对该病害的防治以预防为主。如此，马铃薯黑胫病早期的诊断，以及选育和种植马铃薯抗性品种或者材料有着紧迫的需求。而马铃薯抗性品种或者材料的筛选离不开马铃薯黑胫病的鉴定。所以，目前亟需一种能够快速稳定鉴定马铃薯黑胫病抗性的方法，以鉴别马铃薯感染黑胫病的程度，分析马铃薯对黑胫病的抗性，有利于马铃薯黑胫病的防治和马铃薯抗黑胫病的育种。目前进行马铃薯黑胫病抗性筛选最为常见的方式是利用活体植株为材料，对其马铃薯主茎进行病原菌菌悬液的注射。然而，这种方法存在以下问题：一是细菌会使整株实验材料的死亡导致实验成本高，二是试验材料种植占地面积大导致土地资源浪费，三是在抗病鉴定过程中会出现肉眼难以观察的腐烂症状从而出现定性定级分析不准确。为解决以上问题，研究者们相继创造了马铃薯离体组织或器官接种黑胫病的方法，其中就有叶片接种，该方法是通过在马铃薯叶片打孔并滴入病原菌菌悬液。该方法保护马铃薯植株不被破坏，不会造成资源浪费和成本提高。但是该方法有以下缺点：叶片保水能力较差导致叶片过早失水死亡，无法定性判断病害侵入；细菌悬浮液容易从叶片滑落导致接种失败；由于黑胫病在马铃薯维管束组织体现最为准确，此方法有时会与田间试验结果不一致。综上所述，由于目前常用的鉴定马铃薯黑胫病的方法不稳定，可能会导致筛选出的材料抗性结果不一致，因此遗漏了带有一些非主效QTL的育种材料，错过了某些依靠提高植物自身免疫来提供抗性的候选材料；也可能不能为马铃薯黑胫病的防治提供进一步准确的预判。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术确有必要提供一种马铃薯黑胫病抗性的鉴定方法，以解决上述问题。本专利技术提供的技术方案为：一种马铃薯黑胫病抗性的鉴定方法，包括：准备悬浮液提供一种浓度为103CFU/mL的马铃薯黑胫病病原菌悬浮液；筛选待测叶柄选择有10片完全展开的叶片的马铃薯植株，选取所述马铃薯植株第4-6片成熟健康叶的叶柄作为待测叶柄，该待测叶柄的长度为L0；接种观察将所述马铃薯黑胫病病原菌悬浮液倒入组培瓶中；将待测叶柄插入干燥花泥中，并置于盛有所述马铃薯黑胫病病原菌悬浮液的所述组培瓶中，盖上瓶盖后放入24-26℃、16h光/8h暗的光照培养箱进行培养观察；抗性鉴定利用灯箱和白炽灯观察并记录所述待测叶柄的软化水渍化症状，测量所述待测叶柄的水渍化病变长度，以所述待测叶柄接种培养36h后的病变长度作为叶柄最终病变长度L病，按照分级标准进行病害分级并计算病情指数；依据所述病情指数对马铃薯黑胫病抗性进行评价鉴定：病情指数≤0.2属于抗性，0.2＜病情指数≤0.4属于中抗，0.4＜病情指数≤0.6属于感病，0.8＜病情指数属于易感；其中，病情指数的计算公式如下：所述病害分级标准如下：0≤病变长度L病＜0.08L0，病害等级设置为0级；0.08L0≤病变长度L病＜0.15L0，病害等级设置为1级；0.15L0≤病变长度L病＜0.3L0，病害等级设置为2级；0.3L0≤病变长度L病＜0.6L0，病害等级设置为3级；0.6L0≤病变长度L病＜L0，病害等级设置为4级。基于上述，所述筛选待测叶柄的步骤包括：选择定植后生长5-6周的马铃薯植株，或者选自采用块茎种植且出芽后生长3-4周的马铃薯植株，所述马铃薯植株有10片完全展开的叶片，取第4-6片成熟健康叶的叶柄，并切去叶柄周围多余的叶片，并将叶柄切至统一长度L0作为所述待测叶柄。基于上述，所述待测叶柄的长度L0为-6.5cm。基于上述，所述接种培养的步骤包括：将所述马铃薯黑胫病病原菌悬浮液置于所述组培瓶中；先将具有相同遗传背景的待测材料的若干株所述待测叶柄插入干燥花泥中，再置于盛有所述马铃薯黑胫病病原菌悬浮液的所述组培瓶中，盖上所述组培瓶的瓶盖；将盖上所述瓶盖的组培瓶放入25℃，16h光/8h暗的光照培养箱进行培养观察。基于上述，置于同一组培瓶中的待测叶柄有3-6株。基于上述，所述抗性鉴定的步骤包括：每间隔相同时间，利用光源照射所述光照培养箱中的组培瓶，用肉眼观察叶柄软化水渍化症状，用尺子测量叶柄水渍化病变长度并拍照记录，以所述待测叶柄接种培养36h的病变长度作为最终病变长度L病，按照所述病害分级标准进行分级并计算所述病情指数，依据所述病情指数对马铃薯黑胫病抗性进行评价鉴定。基于上述，所述待测叶柄的长度L0为6.5cm，所述病害分级标准为：0≤病变长度L病＜0.5cm，病害等级设置为0级；0.5cm≤病变长度L病＜1cm，病害等级设置为1级；1cm≤病变长度L病＜2cm，病害等级设置为2级；2cm≤病变长度L病＜4cm，病害等级设置为3级；4cm≤病变长度L病＜6.5cm，病害等级设置为4级。基于上述，所述准备悬浮液的步骤包括：将马铃薯黑胫病病原菌在TSA平板培养基上进行全皿划线培养，并稀释获得OD600值所对应的浓度为103CFU/mL的所述马铃薯黑胫病病原菌悬浮液。在相同条件下，使用本专利技术提供的马铃薯黑胫病抗性的鉴定方法，与现有的田间主茎注射的方法相比，使用本专利技术接病后的发病情况与同样材料田间主茎注射的发病情况基本一致；采用本专利技术提供的鉴定方法仅需要2天左右，鉴定周期短；本专利技术提供的鉴定方法采用离体接种培养，而且病情分为5级，可以避免因田间主茎注射材料在抗病鉴定过程中会出现肉眼难以观察的腐烂症状或者发病不稳定的情况从而出现无法定性定级，最终造成分析结果不准确，鉴定材料结果不清晰；另外，本专利技术采用离体培养，不用在田间试验，避免黑胫病病原菌污染田间土壤，造成环境污染。进一步，经多次试验发现，当采用103CFU/mL的马铃薯黑胫病菌悬浮液接种侵染马铃薯叶柄36h时，叶柄病变长度结果稳定并可重复，浓度过低会导致叶柄病变时间推后且误差值较大，浓度过高会导致叶柄病变时间太快错失一些低抗性的材料。因此，本专利技术提供的马铃薯黑本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种马铃薯黑胫病抗性的鉴定方法，包括：/n准备悬浮液提供一种浓度为10

【技术特征摘要】
1.一种马铃薯黑胫病抗性的鉴定方法，包括：
准备悬浮液提供一种浓度为103CFU/mL的马铃薯黑胫病病原菌悬浮液；
筛选待测叶柄选择有10片完全展开的叶片的马铃薯植株，选取所述马铃薯植株第4-6片成熟健康叶的叶柄作为待测叶柄，该待测叶柄的长度为L0；
接种观察将所述马铃薯黑胫病病原菌悬浮液倒入组培瓶中；将待测叶柄插入干燥花泥中，并置于盛有所述马铃薯黑胫病病原菌悬浮液的所述组培瓶，盖上瓶盖后放入24-26℃、16h光/8h暗的光照培养箱进行培养观察；
抗性鉴定利用灯箱和白炽灯观察并记录所述待测叶柄的软化水渍化症状，测量所述待测叶柄的水渍化病变长度，以所述待测叶柄接种培养36h后的病变长度作为叶柄最终病变长度L病，按照分级标准进行病害分级并计算病情指数；依据所述病情指数对马铃薯黑胫病抗性进行评价鉴定：病情指数≤0.2属于抗性，0.2＜病情指数≤0.4属于中抗，0.4＜病情指数≤0.6属于感病，0.8＜病情指数属于易感；其中，病情指数的计算公式如下：



所述病害分级标准如下：
0≤病变长度L病＜0.08L0，病害等级设置为0级；
0.08L0≤病变长度L病＜0.15L0，病害等级设置为1级；
0.15L0≤病变长度L病＜0.3L0，病害等级设置为2级；
0.3L0≤病变长度L病＜0.6L0，病害等级设置为3级；
0.6L0≤病变长度L病＜L0，病害等级设置为4级。


2.根据权利要求1所述的马铃薯黑胫病抗性的鉴定方法，其特征在于，所述筛选待测叶柄的步骤包括：选择定植后生长5-6周的马铃薯植株或者选自采用块茎种植且出芽后生长3-4周的马铃薯植株，所述马铃薯植株有10片完全展开的叶片，取第4-6片成熟健康叶的叶柄，并切去叶柄周围多余的叶片，并将叶柄切至统一长度L0以作为所述待测叶柄。


3.根据权利要求2所述的马铃薯黑胫病抗性的...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙凯乐，苏玉静，黄松，张涛，孙治强，刘帅，杨世玮，陈红旭，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：河南;41