一种检测喹诺酮类药物残留的试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术涉及食品安全检测技术领域，具体涉及一种检测喹诺酮类药物残留的试剂盒及其检测方法。所述试剂盒包括检测培养基、大肠杆菌冻干菌粉、96微孔板、薄膜贴和对照液。所述试剂盒用于畜禽生肉的喹诺酮类药物残留的检测。本发明专利技术提供的检测试剂盒样品的前处理方法简单，大大减少了检测人员的工作量，节省人力物力；检测试剂盒可以检测多种喹诺酮类药物，并显著的提高了检测灵敏度。

【技术实现步骤摘要】
一种检测喹诺酮类药物残留的试剂盒及其检测方法
本专利技术涉及食品安全检测
，具体涉及一种检测喹诺酮类药物残留的试剂盒及其检测方法。
技术介绍
喹诺酮类药物是一种合成抗菌药物，因其抗菌活性强、抗菌谱广、药物动力学特征好，广泛应用于动物疾病防治。但由于对该类药物的滥用，导致其在动物性食品中的残留超标，人们长期食用喹诺酮类药物残留超标的食品，会引起如过敏反应、人体肠道菌群受干扰以及对该类药物产生耐药性等问题，影响人类的健康。喹诺酮类药物残留问题已引起了广泛关注。目前，畜禽肉中检测抗生素残留方法主要有色谱法、免疫分析法、ELISA检测法和微生物检测法等。其中色谱法较为常用，可以进行定性定量检测，检测结果灵敏准确，但设备投入大，人员技能要求高，适合大型综合性实验室进行仲裁判定和确证；免疫分析法虽灵敏度高，但是检测成本昂贵，只能检测单一抗生素，不易于推广；ELISA检测法灵敏度高，只能检测单一抗生素，且操作繁琐，亦不易于推广。微生物检测法是一种传统经典的测定方法，其利用抗生素对微生物的生理机能、代谢的抑制作用，与阴性对照进行对比，可以反应出待测样本中是否存在抗生素残留。微生物检测法敏感性强、成本低廉、操作简单，可作为一种抗生素初筛方法应用在农产品安全监管环节。因此，提供一种灵敏度高、快速检测畜禽产品中喹诺酮类药物残留的试剂盒具有重要意义。
技术实现思路
有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种检测喹诺酮类药物残留的试剂盒及其检测方法。为实现上述目的，本专利技术采取以下的技术方案：一种检测喹诺酮类药物残留的试剂盒，所述试剂盒包括检测培养基、大肠杆菌冻干菌粉、96微孔板、薄膜贴和对照液。进一步地，在上述检测喹诺酮类药物残留的试剂盒中，所述检测培养基组成成分为：葡萄糖4～8g，蛋白胨6～10g，牛肉浸粉3～6g，磷酸氢二钾10～15g，氯化钠3～8g，亮黑100～200mg，甲苯胺蓝10～20mg，氨苄西林0.5～1mg，溴莫普林50～200ug，蒸馏水1000mL；所述培养基的pH为7.4～7.8。进一步地，在上述检测喹诺酮类药物残留的试剂盒中，检测培养基的制备方法为将检测培养基组成成分完全溶解后，用0.22μm的滤膜过滤，分装到灭菌过的塑料瓶中，4℃保存。进一步地，在上述检测喹诺酮类药物残留的试剂盒中，所述大肠杆菌冻干菌粉的制备方法为：步骤1：菌株复苏：在无菌环境下用接种环从甘油管中挑取大肠杆菌种子液划线至营养琼脂平板上，在30～37℃培养14～24h；步骤2：菌株繁殖：在无菌环境下用接种环从平板上挑取单菌落接种至装有50mL营养肉汤液体培养基的三角瓶中，在30～37℃、150～200rpm/min条件下培养12～20h；步骤3：活菌计数：采用梯度稀释法用无菌生理盐水逐渐将菌液稀释并取100uL涂布于营养琼脂平板上，在30～37℃培养14～24h，计算活菌数，活菌数为109～5×109cfu/mL；将菌液放于4℃保存；步骤4：菌株冻干：吸取菌液与10％脱脂乳载体充分混匀，分装到灭菌过的西林瓶中，每瓶2mL，放于-80℃冰箱中冷冻，待菌液完全结冰后放入冷冻干燥机中，低温冷冻干燥。进一步地，在上述检测喹诺酮类药物残留的试剂盒中，步骤4中菌液与10％脱脂乳载体混合具体方式为先使用无菌生理盐水将菌液稀释100倍，再取稀释后的菌液1mL与100mL10％脱脂乳载体混合。进一步地，在上述检测喹诺酮类药物残留的试剂盒中，所述对照液包括阴性对照液和阳性对照液；所述阴性对照液是pH为5.0的无菌柠檬酸缓冲液；所述阳性对照液为环丙沙星标准液；阳性对照液制备方法为称取10mg环丙沙星，用甲醇溶解并定容至1mg/mL，装于无菌棕色瓶中，负20℃保存。一种喹诺酮类药物残留的检测方法，采用上述试剂盒，包括以下步骤：步骤S1：样品制备：取非冷冻的瘦肉5～10g，切成小块，把碎块放入离心管中；将离心管放入水浴锅中，保持瘦肉样品在水位线以下，水浴5～10min，水浴温度为95℃；然后将离心管以2000～4000rpm/min离心3～6min，收集上清液备用。步骤S2：检测方法：将检测培养基加入到大肠杆菌冻干菌粉中充分混匀，得到混合液；吸取200uL混合液于96微孔板不同的微孔中，吸取步骤S1中上清液50uL加入到装有混合液的微孔中，作为样品检测组；取50uL的阴性对照液加入装有混合液的微孔中，作为阴性对照组；将阳性对照液用阴性对照液稀释浓度至50ppb，取50uL稀释后的阳性对照液，加入装有混合液的微孔中，作为阳性对照组；用薄膜贴密封后在37℃培养箱中培养至阴性样品变色，培养时间为14～18h。步骤S3：结果判定：当阴性对照组中的颜色为黄色且阳性对照微孔中颜色为黑色时，表明样品培养结束；当阴性对照微孔中的颜色为黑色，应继续培养；培养结束后，样品检测组微孔中的颜色为黄色时，表明该检测样品为阴性，样品微孔中的颜色为黑色时，表明该检测样品为阳性。在上述喹诺酮类药物残留的检测方法中，所述样品为畜禽生肉。检测喹诺酮类药物残留的试剂盒在检测畜禽生肉的喹诺酮类药物残留上的应用。本专利技术的有益效果为：本专利技术提供的检测喹诺酮类药物残留的试剂盒，样品的处理方法简单，大大减少了检测人员的工作量，节省人力物力。本专利技术提供的检测试剂盒可以检测多种喹诺酮类药物。本专利技术提供的检测喹诺酮类药物残留的试剂盒的检测培养基中包含氨苄西林和溴莫普林，可以显著提高试剂盒的灵敏度，检测环丙沙星、恩诺沙星、达氟沙星标准样品的灵敏度均可达到25ppb，在检测鸡肉中喹诺酮类药物残留也具有较高的灵敏度，其中检测环丙沙星、恩诺沙星、达氟沙星、培氟沙星均的灵敏度可达到50ppb。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术的技术方案作进一步清楚、完整地描述。需要说明的是，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术所采用的原料和试剂：大肠杆菌种子液，本实验室分离保藏；10％脱脂乳载体，购自上海生工，编号A600669-0250；氨苄西林，购自阿拉丁，CAS号：7177-48-2；溴莫普林，购自吉至生化，CAS号：56518-41-3；薄膜贴，购自上海生工，编号F600418-0001；微孔板，购自美国康宁公司。在本专利技术的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。实施例1、检测喹诺酮类药物残留的试剂盒一种检测喹诺酮类药物残留的试剂盒，所述试剂盒包括检测培养基、大肠杆菌冻干菌粉、96微孔板、薄膜贴和对照液。所述检测培养基组成成分为：葡萄糖5g，蛋白胨10g，牛肉浸粉4g，磷酸氢二钾本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测喹诺酮类药物残留的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测培养基、大肠杆菌冻干菌粉、96微孔板、薄膜贴和对照液。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测喹诺酮类药物残留的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测培养基、大肠杆菌冻干菌粉、96微孔板、薄膜贴和对照液。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述检测培养基组成成分为：葡萄糖4～8g，蛋白胨6～10g，牛肉浸粉3～6g，磷酸氢二钾10～15g，氯化钠3～8g，亮黑100～200mg，甲苯胺蓝10～20mg，氨苄西林0.5～1mg，溴莫普林50～200ug，蒸馏水1000mL；所述培养基的pH为7.4～7.8。


3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，检测培养基的制备方法为将检测培养基组成成分完全溶解后，用0.22μm的滤膜过滤，分装到灭菌过的塑料瓶中，4℃保存。


4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述大肠杆菌冻干菌粉的制备方法为：
步骤1：菌株复苏：在无菌环境下用接种环从甘油管中挑取大肠杆菌种子液划线至营养琼脂平板上，在30～37℃培养14～24h；
步骤2：菌株繁殖：在无菌环境下用接种环从平板上挑取单菌落接种至装有50mL营养肉汤液体培养基的三角瓶中，在30～37℃、150～200rpm/min条件下培养12～20h；
步骤3：活菌计数：采用梯度稀释法用无菌生理盐水逐渐将菌液稀释并取100uL涂布于营养琼脂平板上，在30～37℃培养14～24h，计算活菌数，活菌数为109～5×109cfu/mL；将菌液放于4℃保存；
步骤4：菌株冻干：吸取菌液与10％脱脂乳载体充分混匀，分装到灭菌过的西林瓶中，每瓶2mL，放于-80℃冰箱中冷冻，待菌液完全结冰后放入冷冻干燥机中，低温冷冻干燥。


5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，步骤4中菌液与10％脱脂乳载体混合具体方式为先使用无菌生理盐水将菌液稀释100倍，再取稀释后的菌液...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘伟，余国莲，曾道平，杜云平，杨金易，周庆丰，陈丽，
申请(专利权)人：新兴县国研科技有限公司，温氏食品集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44