特征肽段、检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了特征肽段，至少包括氨基酸序列分别为QGLLPVLESFK、LSPLGEEMR、LGPLVEQGR、AATVGSLAGQPLQER、LQAEAFQAR、VTTVASHTSDSDVPSGVTEVVVK以及TLLSNLEEAK的肽段。本发明专利技术还提供了检测方法和试剂盒。本发明专利技术利用特征肽段对应的同位素标记肽段作为内标物，实现同时、定量检测血浆或血清中载脂蛋白A、载脂蛋白E、载脂蛋白J的浓度。

【技术实现步骤摘要】
特征肽段、检测方法及试剂盒
本专利技术涉及蛋白质检测
更具体地说，本专利技术涉及载脂蛋白A、载脂蛋白E、载脂蛋白J定量检测相关的特征肽段、检测方法及试剂盒。
技术介绍
脂蛋白中蛋白部分称为载脂蛋白(Apolipoprotein,Apo)，载脂蛋白在脂蛋白代谢中具有重要生理功能。载脂蛋白的主要功能有：①维持脂蛋白的结构与脂类运输；②调控脂代谢有关酶的活性；③作为细胞表面脂蛋白受体的配体而参与脂蛋白的代谢。载脂蛋白一般分为载脂蛋白A、载脂蛋白B、载脂蛋白C、载脂蛋白D、载脂蛋白E和载脂蛋白J等，每种又分为若干亚型。载脂蛋白A(ApolipoproteinA，ApoA)是构成血浆高密度脂蛋白的重要组分，具有清除组织脂质和抗动脉粥样硬化的作用。载脂蛋白A-Ⅱ(ApoAⅡ)是载脂蛋白A家族中最重要的组分之一。ApoAⅡ可以水解乳糜微粒(CM)和极低密度脂蛋白(VLDL)中的甘油三酯，其血清浓度与发生冠心病的危险性呈负相关。载脂蛋白E(ApolipoproteinE，ApoE)是一种多态性蛋白，参与脂蛋白的转化与代谢过程，其基因可以调节许多生物学功能，与许多眼科疾病发病有关，对ApoE及其基因多态性的研究是目前医学研究的热点之一，探讨两者之间的内在联系，对眼病的预防、诊断及治疗具有重要的临床应用价值。ApoE主要存在于CM、VLDL、中密度脂蛋白(IDL)和部分高密度脂蛋白(HDL)中，ApoE的浓度与血浆甘油三酯含量呈正相关。载脂蛋白J(ApolipoproteinJ，ApoJ)是HDL和VHDL相结合的糖蛋白，它是一种分子量约为70KD的二聚体蛋白质。广泛分布于人体各种组织，除了负责运输脂质外，还参与补体功能调节、精子成熟、膜再循环等生理过程以及与某些疾病的发病有关。传统的大分子蛋白类化合物定量研究多采用等电聚焦电泳、双向凝胶电泳、免疫印迹等方法进行测定，对于含量较低的蛋白类化合物酶联免疫吸附方法(enzyme-linkedimmunosorbentassays，ELISA)和放射性免疫标记方法(radioimmunoassay,RIA)具有其独特优势。其中ELISA因其较高灵敏度和适合批量测定等优点，已成为最为常用的蛋白多肽类化合物生物样品分析方法。但传统的免疫方法存在开发周期长、成本高，存在蛋白交叉反应等缺陷。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种特征肽段、检测方法及试剂盒，利用特征肽段对应的同位素标记肽段作为内标物，实现同时、定量检测血浆或血清中载脂蛋白A、载脂蛋白E、载脂蛋白J的浓度。为了实现根据本专利技术的这些目的和其它优点，根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了特征肽段，至少包括氨基酸序列分别为QGLLPVLESFK、LSPLGEEMR、LGPLVEQGR、AATVGSLAGQPLQER、LQAEAFQAR、VTTVASHTSDSDVPSGVTEVVVK以及TLLSNLEEAK的肽段。根据本专利技术的另一个方面，本专利技术提供了检测方法，包括在同时检测载脂蛋白A、载脂蛋白E以及载脂蛋白J时，将与权利要求1中所述特征肽段对应的同位素标记肽段作为内标物。进一步地，所述的检测方法，包括：配制同位素标记肽段内标液；利用替代基质配制所述特征肽段的校正标样；取待测样品，依次用二硫苏糖醇溶液、碘乙酰胺溶液、胰蛋白酶进行处理，加入同位素标记肽段内标液，上柱，洗脱，氮气吹干或冷冻干噪，复溶，得待测样品溶液；取所述校正标样，加入同位素标记肽段内标液，用液相色谱质谱联用仪器进行分析，记录所述特征肽段的峰面积以及对应的同位素标记肽段的峰面积，建立以峰面积之比和浓度为坐标的标准曲线；将所述待测样品溶液用液相色谱质谱联用仪器进行分析，记录所述特征肽段的峰面积以及对应的同位素标记肽段的峰面积，将峰面积之比代入标准曲线，计算载脂蛋白A、载脂蛋白E、载脂蛋白J的浓度。进一步地，所述的检测方法，还包括：利用替代基质配制所述特征肽段的质控样品，向质控样品中加入同位素标记肽段内标液，用液相色谱质谱联用仪器进行分析，记录所述特征肽段的峰面积以及对应的同位素标记肽段的峰面积，将峰面积之比代入标准曲线，计算质控样品回收率值。进一步地，所述的检测方法，所述替代基质的制备方法包括：取牛清白蛋白，依次用二硫苏糖醇溶液、碘乙酰胺溶液和胰蛋白酶进行处理，上柱，洗脱，氮气吹干或冷冻干噪，复溶，得替代基质。进一步地，所述的检测方法，液相色谱质谱联用仪器为LC-MS/MS；质谱条件包括：离子源为电喷雾离子源，正离子方式检测，扫描方式为多重反应监测。进一步地，所述的检测方法，多重反应监测的参数包括：其中，VTTVASHTSDSDVPSGVTEVVVK*、TLLSNLEEAK*、LGPLVEQGR*、AATVGSLAGQPLQER*、LQAEAFQAR*、QGLLPVLESFK*、LSPLGEEMR*分别表示特征肽段VTTVASHTSDSDVPSGVTEVVVK、TLLSNLEEAK、LGPLVEQGR、AATVGSLAGQPLQER、LQAEAFQAR、QGLLPVLESFK、LSPLGEEMR的对应的同位素标记肽段。色谱条件包括：色谱柱为PhenomenexAerisWIDEPORE3.6μmXB-C18，150×2.1mm；流动相为0.1％甲酸水溶液-0.1％甲酸乙腈，梯度洗脱；柱温为40℃；进样量为10μL。根据本专利技术的又一个方面，本专利技术提供了试剂盒，包括：内标液，其由与权利要求1中所述特征肽段对应的同位素标记肽段配制得到；校正标样，其由替代基质和所述特征肽段配制得到；二硫苏糖醇溶液和碘乙酰胺溶液，用于处理待测样品。进一步地，所述的试剂盒，还包括：质控样品，其由替代基质和所述特征肽段配制得到，所述质控样品至少包括高、中、低三种不同浓度。进一步地，所述的试剂盒，还包括：缓冲液1和缓冲液2，缓冲液1由碳酸氢铵、尿素和水配制而成，缓冲液2由碳酸氢铵和水配制而成。本专利技术至少包括以下有益效果：本专利技术将氨基酸序列为QGLLPVLESFK、LSPLGEEMR、LGPLVEQGR、AATVGSLAGQPLQER、LQAEAFQAR、VTTVASHTSDSDVPSGVTEVVVK以及TLLSNLEEAK的肽段作为特征肽段，利用特征肽段配制校正标液，利用特征肽段对应的同位素标记肽段作为内标物，借助液相色谱质谱联用仪器，能够实现同时、定量检测血浆或血清中载脂蛋白A、载脂蛋白E、载脂蛋白J的浓度。本专利技术的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本专利技术的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。附图说明图1为载脂蛋白A、载脂蛋白E、载脂蛋白J的检测流程图；图2为载脂蛋白A、载脂蛋白E、载脂蛋白J的特征肽段和同位素内标[M+H]+的二级全扫描质谱图；图3为载脂蛋白A、载脂蛋白E、载脂蛋白J特征肽段和同位素内标的典型提取离子流色谱图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.特征肽段，其特征在于，至少包括氨基酸序列分别为QGLLPVLESFK、LSPLGEEMR、LGPLVEQGR、AATVGSLAGQPLQER、LQAEAFQAR、VTTVASHTSDSDVPSGVTEVVVK以及TLLSNLEEAK的肽段。/n

【技术特征摘要】
1.特征肽段，其特征在于，至少包括氨基酸序列分别为QGLLPVLESFK、LSPLGEEMR、LGPLVEQGR、AATVGSLAGQPLQER、LQAEAFQAR、VTTVASHTSDSDVPSGVTEVVVK以及TLLSNLEEAK的肽段。


2.检测方法，其特征在于，包括在同时检测载脂蛋白A、载脂蛋白E以及载脂蛋白J时，将与权利要求1中所述特征肽段对应的同位素标记肽段作为内标物。


3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，包括：
配制同位素标记肽段内标液；
利用替代基质配制所述特征肽段的校正标样；
取待测样品，依次用二硫苏糖醇溶液、碘乙酰胺溶液、胰蛋白酶进行处理，加入同位素标记肽段内标液，上柱，洗脱，氮气吹干或冷冻干噪，复溶，得待测样品溶液；
取所述校正标样，加入同位素标记肽段内标液，用液相色谱质谱联用仪器进行分析，记录所述特征肽段的峰面积以及对应的同位素标记肽段的峰面积，建立以峰面积之比和浓度为坐标的标准曲线；
将所述待测样品溶液用液相色谱质谱联用仪器进行分析，记录所述特征肽段的峰面积以及对应的同位素标记肽段的峰面积，将峰面积之比代入标准曲线，计算载脂蛋白A、载脂蛋白E、载脂蛋白J的浓度。


4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，还包括：
利用替代基质配制所述特征肽段的质控样品，向质控样品中加入同位素标记肽段内标液，用液相色谱质谱联用仪器进行分析，记录所述特征肽段的峰面积以及对应的同位素标记肽段的峰面积，将峰面积之比代入标准曲线，计算质控样品回收率值。


5.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述替代基质的...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘丽宏，李鹏飞，丛宇婷，张文，李国庆，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京朝阳医院，
类型：发明
国别省市：北京;11