一种改进的高效液相色谱串联质谱人血清中15种胆汁酸的检测方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及一种改进的人血清中15种胆汁酸的高效液相色谱串联质谱检测方法，包括蛋白质沉淀、样品稀释、高效液相色谱串联质谱法进行分析检测。本方法具有效率高、成本低、操作简便、准确度和灵敏度高等优点，适合大量临床样本的快速检测。

【技术实现步骤摘要】
一种改进的高效液相色谱串联质谱人血清中15种胆汁酸的检测方法
本专利技术属于生物
，特别涉及一种改进的人血清中15种胆汁酸的高效液相色谱串联质谱检测方法，本方法步骤包括蛋白质沉淀、样品稀释、高效液相色谱串联质谱法进行分析检测，具有效率高、成本低、操作简便、准确度和灵敏度高等优点，适合大量临床样本的快速检测。
技术介绍
胆汁酸为胆汁的主要成分，是一类胆烷酸的总称。胆汁酸具有多种同分异构体，根据结构可分为游离型和结合型胆汁酸，游离型胆汁酸主要包括胆酸、脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸和石胆酸，结合型胆汁酸为上述游离型胆汁酸与甘氨酸和牛磺酸结合的产物。根据生成部位，胆汁酸又可分为初级和次级胆汁酸。胆汁酸主要在肝细胞中合成代谢转化，胆汁酸在脂肪代谢中发挥重要作用，例如，胆汁酸可以促进脂肪分解吸收，胆汁酸的分子结构同时具有亲水性和疏水性基团，与界面活性分子一样，能够降低油相和水相之间的表面张力，促进脂类的乳化。同时，胆汁酸可预防人体胆结石产生，胆固醇随胆汁排入胆囊中储存，胆囊中胆汁浓缩后，胆固醇易沉淀析出形成胆结石，胆汁酸盐和卵磷脂可以使胆固醇分散成可本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种改进的人血清中15种胆汁酸的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)溶液的配制；/nA.一级储备液的配制：精密称取人血清中胆汁酸标准品，加入20％甲醇溶液溶解稀释得到一级储备液；/nB.二级混合储备液的配制：依次将适量的一级储备液加入到同一离心管中，涡旋混匀，得到二级混合储备液(MIX01)；/nC.标准工作液配制：量取二级混合储备液(MIX01)，加入20％甲醇溶液，混合均匀，得到三级混合储备液(MIX02)；用甲醇分别稀释三级储备溶液配成标准曲线工作液；/nD.内标工作液配制：精密称取4种内标标准品，加入20％甲醇溶液溶解稀释得到1mg/mL的氘代甘氨胆酸...

【技术特征摘要】
1.一种改进的人血清中15种胆汁酸的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)溶液的配制；
A.一级储备液的配制：精密称取人血清中胆汁酸标准品，加入20％甲醇溶液溶解稀释得到一级储备液；
B.二级混合储备液的配制：依次将适量的一级储备液加入到同一离心管中，涡旋混匀，得到二级混合储备液(MIX01)；
C.标准工作液配制：量取二级混合储备液(MIX01)，加入20％甲醇溶液，混合均匀，得到三级混合储备液(MIX02)；用甲醇分别稀释三级储备溶液配成标准曲线工作液；
D.内标工作液配制：精密称取4种内标标准品，加入20％甲醇溶液溶解稀释得到1mg/mL的氘代甘氨胆酸(GCA-d5)、氘代牛磺胆酸(TCA-d5)、氘代牛磺脱氧胆酸(TDCA-d4)和氘代牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA-d5)的一级储备液；取GCA-d5一级储备液、TCA-d5一级储备液、TDCA-d4一级储备液和TUDCA-d5一级储备液，合并，用20％甲醇溶液稀释，涡旋混匀，得到内标二级混合储备液；取内标二级混合储备液加入到20％甲醇溶液中得到内标工作液；
(2)取人血清样本，加入离心管中，一次加入甲醇和内标工作液，1500rpm涡旋，14000g离心；
(3)取步骤(2)处理得到的上清液，加入20％甲醇溶液作为稀释剂，涡旋混匀后，上SCIEX4500MD三重四级杆高效液相色谱串联质谱联用系统进样20μL分析。


2.根据权利要求1的方法，所述人血清中15种胆汁酸包括胆酸(CA)、脱氧胆酸(DCA)、鹅脱氧胆酸(CDCA)、熊脱氧胆酸(UDCA)、石胆酸(LCA)、甘氨胆酸(GCA)、甘氨脱氧胆酸(GDCA)、甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)、甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)、甘氨石胆酸(GLCA)、牛磺胆酸(TCA)、牛磺脱氧胆酸(TDCA)、牛磺鹅脱氧胆酸(TCDCA)、牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)和牛磺石胆酸(TLCA)。


3.根据权利要求1的方法，步骤(3)所述高效液相色谱串联质谱法测定经预处理后的样品溶液，采用梯度洗脱反相色谱法建立待测物的分离条件为：色谱柱为C8柱、C18柱或者苯基柱，填料粒径为1.7～5μm，内径为2.1～4.6mm，柱长为25～150mm，柱温为35～50℃；流动相A为5mM醋酸铵溶液，流动相B为甲醇，流动相A和流动相B的体积比为35～2％：65～98％；A相与B相按梯度程序洗脱，流动相流速为0.4～1mL/min。


4.根据权利要求1的方法，步骤(3)所述高效液相色谱串联质谱检测采用电喷雾离子源(ESI)和MRM检测模式，用于检测的分析物和内标的母离子/子离子检测离子对如下所示，胆酸(CA)，m/z407.2>m/z407.2和m/z407.2>m/z343.1；脱氧胆酸(DCA)，m/z391.3>m/z391.3和m/z391.3>m/z345.4；鹅脱氧胆酸(CDCA)，m/z391.3>m/z391.3和m/z391.3>m/z373.2；熊脱氧胆酸(UDCA)，m/z391.4>m/z391.4和m/z391.3>m/z373.1；石胆酸(LCA)，m/z375.3>m/z375.3和m/z375.3>m/z357.3；甘氨胆酸(GCA)，m/z464.4>m/z74.1和m/z464.4>m/z402.3；甘氨脱氧胆酸(GDCA)，m/z448.3>m/z74.2和m/z448.3>m/z404.4；甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)，m/z448.3>m/z74.1和m/z448.4>m/z386.4；甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)，m/z448.3>m/z74.2和m/z448.3>m/z386.3；甘氨石胆酸(GLCA)，m/z432.3>m/z74.0和m/z432.3>m/...

【专利技术属性】
技术研发人员：马金飞，杨青青，孔子清，刘华芬，
申请(专利权)人：杭州凯莱谱精准医疗检测技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33