一种带有标记的棉花雄性不育系的创制方法技术

本发明专利技术属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种带有标记的棉花雄性不育系的创制方法。本发明专利技术提供利用CRISPR‑Cas9系统创造带有新型标记的棉花雄性不育系。本发明专利技术的特征在于，选取特异针对GhEMS1基因的靶位点sgRNA1、sgRNA2，与Cas9蛋白在棉花内稳定表达，获得带有新型标记的棉花雄性不育系。转基因再生植株的花药表面带有黑斑表型可稳定地遗传至下一代，且不育性稳定。本发明专利技术的优点在于克服了传统人工去雄方法做杂交费时费力的缺陷，并且不育株带有黑斑标记，便于早期确定不育株。

【技术实现步骤摘要】
一种带有标记的棉花雄性不育系的创制方法
本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及一种带有标记的棉花雄性不育系的创制方法及其应用。本专利技术提供利用CRISPR-Cas9系统创造带有新型标记的棉花雄性不育系创制方法。选取特异针对GhEMS1基因的靶位点sgRNA1、sgRNA2，与Cas9蛋白在棉花内稳定表达，获得带有新型标记的棉花雄性不育系。转基因再生植株的花药表面带有黑斑表型可稳定遗传至下一代，且棉花雄性不育性稳定。本专利技术的优点在于克服了传统人工去雄方法做杂交费时费力的缺陷，并且不育株带有黑斑标记，便于早期确定不育株。
技术介绍
杂种优势可以大幅度提高农作物产量，棉花作为重要的经济作物，也具有明显的杂交优势，陆地棉品种间杂交种的强优势组合可增产20％～30％。在20世纪90年代取得突破，培育出一大批抗虫优质杂交棉品种，在生产上大面积推广应用。例如，中国农业科学院棉花研究所的培育的“中棉所”系列，华中农业大学培育的的“华杂棉”系列，山东省棉花研究中心培育的“鲁棉研”系列，湖南省棉花研究所培育的“湘杂棉”系列等等。在棉花雄性不育利用方面，四川省农业科学院于1972年发现“洞A型”细胞核雄性不育系后，随即开展棉花细胞核雄性不育系及杂交种选育，培育出“川杂”系列核不育杂交种。国内多个单位利用引进“洞A型”核不育两用系或转育出新的核不育系，也培育一系列杂交种。中国农业科学院棉花研究所引进ms5ms5ms6ms6双隐性核不育系，通过杂交和回交改良，培育出“中棉所38”等多个杂交棉品种。河北省邯郸市农业科学院从海陆杂种后代中筛选出104-7A胞质不育系，育成了“邯杂98-1”等多个国家审定或省审定的三系杂交棉品种。现有的人工去雄授粉制种方法费工费时，近年来随着农村劳动力短缺，杂交棉种子成本逐年高涨，杂交棉应用面积大幅度减少，因此创造出育性稳定可靠的雄性不育系是我国杂交棉生产必须解决的技术问题。CRISPR/Cas9系统直接作用于DNA，可对几乎任意基因组区域进行编辑，影响相应基因的功能，方法简单、精确、高效，成为近年植物基因组学研究的热点。在棉花上，Wang等(Wangetal.2018)针对1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(Cloroplastoalterados，CLA)的A、D亚基因组设计了两个sgRNA，以指导Cas9介导的异源四倍体棉花基因组编辑。测序结果表明，两个靶位点分别发生了80％以上的突变频率，所有样品均未检测到脱靶的情况，说明CRISPR/Cas9系统可以高效率和高特异性在异源四倍体棉花基因组上产生DNA水平突变。基因编辑在植物不育系的创制上得到有效应用，水稻TMS5是中国应用广泛的温敏核雄性不育系的主效基因，Zhou等在TMS5的编码区设计了10个靶位点，使用CRISPR/Cas9系统进行定向诱变，创造了新的不含转基因元件的温敏不育系。建立的TMS5ab二元构建体，可用于籼、粳两个亚种的温敏不育系快速培育(Zhouetal.2016)。Ms45是玉米中发现的一个雄性不育基因，该基因编码一种花粉发育必需的类胡萝卜素合成酶。Singh等(Singhetal.2018)为了研究Ms45基因在小麦中的作用，使用CRISPR/Cas9技术，对小麦3个同源染色A、B和D的Ms45同源基因进行了编辑，获得突变体。三个同源位点的同时突变，造成小麦的雄性不育，该不育系可被非同时突变的材料恢复育性。Chen等通过基因编辑技术，对玉米的育性相关基因MS8进行了编辑，得到新的玉米雄性不育系(Chenetal.2018)。通过基因编辑技术创造棉花雄性不育系应是一个便捷有效的手段。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服棉花现有杂交育种中雄性不育系不完全败育、无明显标记的不足，提供一种带有标记快速创制棉花雄性不育系的创制方法及其应用。本专利技术包括pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ载体构建(Wangetal.2018)，针对GhEMS1基因构建基因编辑载体来转化棉花，创造出带有特定标记的棉花雄性不育系。本专利技术的技术方案如下所述：一种同时被敲除了三个基因的且花药表面带有黑斑标记的棉花雄性不育系的创制方法，包括下列步骤：(1)在陆地棉中筛选得到可以作为标记的GhEMS1基因的三个DNA片段，所述的DNA片段分别如SEQIDNO：1(命名为Ghir_A08G010860)，SEQIDNO：2(命名为Ghir_D08G010810)和SEQIDNO：3所示(命名为Ghir_A09G018830)，以三个DNA片段的保守区域设计共有的靶位点sgRNA1和sgRNA2；其中sgRNA1的核苷酸序列如下所示：sgRNA1：AACCTGACCGCTCTTTACAT；sgRNA2的核苷酸序列分别如下所示：sgRNA2：CAGTGAAATTGTTGGAGTCA；(2)利用重叠延伸的PCR方法将sgRNA1-guidRNA和sgRNA2-guidRNA串连，然后通过一步克隆法构建到CRISPR/Cas9载体pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ(Wangetal.2018)，得到高效转化载体GhU6.7::sgRNA1-sgRNA2。(3)利用农杆菌介导的方法转化棉花(棉花品种如陆地棉品种豫668，但是实施本专利技术不限于该棉种和品种)，得到带有标记的棉花雄性不育系。(4)通过T0代单株测序，PAGE(polyacrylamidegelelectrophoresis)胶和高通量测序验证GhEMS1基因产生编辑并无脱靶现象。(5)通过对T1代单株观察，测序鉴定本专利技术的基因编辑方法的可遗传性。(6)通过半薄切片和TUNEL染色实验方法(Minetal.2013)，得到一种突变体Ghems1，该突变体无法形成中间层和绒毡层，因而小孢子母细胞由于得不到营养进而降解。(7)将T1代完全不育材料与野生型(即非转基因)陆地棉品种杂交获得杂交F1代，其杂交后代表现该不育系雌性发育正常。本专利技术克隆的的sgRNA1、sgRNA2可在培育棉花雄性不育系中应用。本专利技术的有益效果如下：(1)本专利技术发现了利用构建的GhU6.7::sgRNA1-sgRNA2载体同时突变棉花中Ghir_A08G010860基因片段、Ghir_D08G010810基因片段、和Ghir_A09G018830三个基因片段可以创造出棉花雄性不育植株。(2)本专利技术鉴定的sgRNA1和sgRNA2序列具有较高特异性核编辑效率。(3)本专利技术中的雄性不育系带有黑斑标记，容易识别，便于早期确定不育株。且雄性不育系黑斑表型可稳定遗传至下一代，不育性稳定。(4)本专利技术的雄性不育系败育率为100％。附图说明图1：是本专利技术的T0代单株表型图。附图标记说明：图1中的A图:WT(wildtype)野生型单株花药，图1中的B图，图1中的C图，图1中的D图分别为H3、E67、E27突变体单株花药；图1中的E、图1中的F、图1中的G、图1中的H分别为WT、H3、E67、E27本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种同时被敲除三个基因的且花药表面带有黑斑标记的棉花雄性不育系的创制方法，其特征包括下列步骤：/n(1)在陆地棉中筛选得到可以作为标记的GhEMS1基因的三个DNA片段，所述的DNA片段分别如SEQ ID NO：1(片段命名：Ghir_A08G010860)，SEQ ID NO：2(片段命名：Ghir_D08G010810)和SEQ ID NO：3所示(片段命名：Ghir_A09G018830)，以上述三个DNA片段的保守区域设计共有的靶位点sgRNA1和sgRNA2；/n其中sgRNA1的核苷酸序列如下所示：/nsgRNA1：AACCTGACCGCTCTTTACAT；/nsgRNA2的核苷酸序列分别如下所示：/nsgRNA2：CAGTGAAATTGTTGGAGTCA；/n(2)利用PCR方法将sgRNA1-guidRNA与sgRNA2-guidRNA进行串连，通过一步克隆法构建到CRISPR/Cas9载体上，最终得到高效转化载体GhU6.7::sgRNA1-sgRNA2；/n(3)利用农杆菌介导的方法转化宿主棉花，获得花药表面带有黑斑标记的棉花雄性不育系。/n

【技术特征摘要】
1.一种同时被敲除三个基因的且花药表面带有黑斑标记的棉花雄性不育系的创制方法，其特征包括下列步骤：
(1)在陆地棉中筛选得到可以作为标记的GhEMS1基因的三个DNA片段，所述的DNA片段分别如SEQIDNO：1(片段命名：Ghir_A08G010860)，SEQIDNO：2(片段命名：Ghir_D08G010810)和SEQIDNO：3所示(片段命名：Ghir_A09G018830)，以上述三个DNA片段的保守区域设计共有的靶位点sgRNA1和sgRNA2；
其中sgRNA1的核苷酸序列如下所示：
sgRNA1：AACCTGACCGCTCTTTACAT；
sgRNA2的核苷酸序列分别如下所示...

【专利技术属性】
技术研发人员：闵玲，张军，徐孝兰，李宁，张献龙，郭小平，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42