一种提高获得基因编辑植株概率的筛选系统、构建方法及其应用技术方案

本发明专利技术涉及一种提高获得基因编辑植株概率的方法及其应用。本发明专利技术将一个新的可见光下裸眼可视报告系统的表达盒与基因编辑系统的表达盒连锁到一个载体上，对植物进行遗传转化。因为与基因编辑系统发生连锁的报告系统能在植物体内产生红色的甜菜红素，且基因编辑表达盒在植物细胞中成功表达是植物被编辑的前提，所以可以直接通过甜菜红素的产生来指示基因编辑表达盒正常表达，从而直接通过可见光下裸眼可视植物体的颜色来挑选发生基因编辑的植株。本发明专利技术有效避免了通过抗生素筛选获得的植株中存在部分植株未发生靶位点编辑的情况，成功实现通过甜菜红素报告系统高效获得靶位点被编辑的植株。

【技术实现步骤摘要】
一种提高获得基因编辑植株概率的筛选系统、构建方法及其应用
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种新的提高获得基因编辑植株概率的筛选系统及其应用。本专利技术的筛选系统通过植物体内产生的可见光下可被裸眼直接观察的色素作为标记来筛选获得发生基因编辑的植株。本专利技术还涉及上述筛选系统的构建和应用。
技术介绍
基因编辑的技术核心为利用序列特异核酸酶(Sequence-specificnucleases,SSNs)诱导DNA双链断裂(Double-strandedbreaks,DSBs)，随后对基因组进行靶向定点突变。因为生物体的DNA发生DSBs后，其自我修复机制会启动，将断裂的DNA修复，目前主要发现有两种修复形式。其一，大部分情况下，修复机制会直接将断裂位置的染色体连接起来，发生非同源重组连接(Nonhomologousendjoining,NHEJ)。因NHEJ不能保证非常精确的修复，使得在断裂位置出现核苷酸的缺失或者插入从而导致基因发生突变，所以可以利用该特性来创制靶位点定点突变的突变体。其二，在有同源核酸模板存在的情况下，生物体在修复DSBs的时候能以同源核酸为模板对断裂位置进行同源重组修复(homology-directedrepair，HDR)，因为有模板的存在，HDR会产生精确的修复，如果在模板中设计一些人为的突变则会将这些突变精确地引入生物体的基因组中。但是目前的研究结果表明，即便是在有同源核酸模板存在，NHEJ发生的概率也远远高于HDR(WymanC,KanaarR.DNAdouble-strandbreakrepair:all'swellthatendswell.AnnuRevGenet,2006,40:363-383；SymingtonLS,GautierJ.Double-strandbreakendresectionandrepairpathwaychoice.AnnuRevGenet,2011,45:247-271)。目前主要有三种SSN被实际应用于基因编辑：锌指核酸酶(Zincfingernucleases,ZFN)(KimYG,ChaJ,ChandrasegaranS.Hybridrestrictionenzymes:zincfingerfusionstoFokIcleavagedomain.ProcNatlAcadSciUSA,1996,93(3):1156-1160)、转录激活样效应因子核酸酶(Transcriptionactivator-likeeffectornucleases,TALEN)(ChristianM,CermakT,DoyleEL,SchmidtC,ZhangF,HummelA,BogdanoveAJ,VoytasDF.TargetingDNAdouble-strandbreakswithTALeffectornucleases.Genetics,2010,186(2):757-761；MillerJC,TanS,QiaoG,BarlowKA,WangJ,XiaDF,MengX,PaschonDE,LeungE,HinkleySJ,DulayGP,HuaKL,AnkoudinovaI,CostGJ,UrnovFD,ZhangHS,HolmesMC,ZhangL,GregoryPD,RebarEJ.ATALEnucleasearchitectureforefficientgenomeediting.NatBiotechnol,2011,29(2):143-148；ZhangF,CongL,LodatoS,KosuriS,ChurchGM,ArlottaP.Efficientconstructionofsequence-specificTALeffectorsformodulatingmammaliantranscription.NatBiotechnol,2011,29(2):149-153)和成簇规律间隔短回文重复序列及其相关系统，即CRISPR/Cas系统(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/CRISPRassociatedproteins,CRISPR/Cassystem)(JinekM,ChylinskiK,FonfaraI,HauerM,DoudnaJA,CharpentierE.Aprogrammabledual-RNA-guidedDNAendonucleaseinadaptivebacterialimmunity.Science,2012,337(6096):816-821；CongL,RanFA,CoxD,LinS,BarrettoR,HabibN,HsuPD,WuX,JiangW,MarraffiniLA,ZhangF.MultiplexgenomeengineeringusingCRISPR/Cassystems.Science,2013,339(6121):819-823)。其中以CRISPR/Cas系统操作最为简便，因此被广泛用于靶向突变体的创制。CRISPR/Cas基因编辑最初发现于古菌和细菌，并通过生化手段阐明了其作用机理(JinekM,ChylinskiK,FonfaraI,HauerM,DoudnaJA,CharpentierE.Aprogrammabledual-RNA-guidedDNAendonucleaseinadaptivebacterialimmunity.Science,2012,337(6096):816-821)。随后该技术在动物中也被证明能对DNA进行靶向编辑(CongL,RanFA,CoxD,LinS,BarrettoR,HabibN,HsuPD,WuX,JiangW,MarraffiniLA,ZhangF.MultiplexgenomeengineeringusingCRISPR/Cassystems.Science,2013,339(6121):819-823)。理论上CRISPR/Cas基因编辑正常发挥功能只需要满足三个要求：1.核定位的CAS9蛋白；2.具有20个靶序列特异性核苷酸的gRNA；3.基因组中与靶序列相邻的3'末端为前间区序列邻近基序(protospacer-adjacentmotif，PAM)，PAM在CAS9系统中为NGG，在Cas9的变体Cas9-NG或者xCas9中PAM几乎简化为NG(HuJH,,etal.EvolvedCas9variantswithbroadPAMcompatibilityandhighDNAspecificity.Nature,2018,556(7699):57-63；NishimasuH,etal.EngineeredCRISPR-Cas9nucleasewithexpandedtargetingspace.Science,2018,361(6408):1259-1262)。根据CRISPR/Cas的作用机理以及该技术在动物中的成功应用，该技术迅速在植物中被应用，目前CRISPR/Cas系统已经成功地在多种植物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高获得基因编辑植株概率的筛选系统，其特征在于，所述筛选系统为包括RUBY基因表达盒和CRISPR/Cas基因编辑系统的植物遗传转化载体；所述RUBY基因表达盒包括顺次设置的启动子、RUBY基因、终止子。/n

【技术特征摘要】
1.一种提高获得基因编辑植株概率的筛选系统，其特征在于，所述筛选系统为包括RUBY基因表达盒和CRISPR/Cas基因编辑系统的植物遗传转化载体；所述RUBY基因表达盒包括顺次设置的启动子、RUBY基因、终止子。


2.根据权利要求1所述的提高获得基因编辑植株概率的筛选系统，其特征在于，所述RUBY基因包括CYP76AD1基因、DODA基因和GT基因；
所述CYP76AD1基因的核苷酸序列包含编码SEQIDNO.1所示CYP76AD1氨基酸序列的核苷酸序列，
所述DODA基因的核苷酸序列包含编码SEQIDNO.2所示DODA氨基酸序列的核苷酸序列，
所述GT基因的核苷酸序列包含编码SEQIDNO.3所示GT氨基酸序列的核苷酸序列；优选的，所述CYP76AD1基因的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，所述DODA基因的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示，所述GT基因的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。


3.根据权利要求2所述的提高获得基因编辑植株概率的筛选系统，其特征在于，所述CYP76AD1基因、DODA基因和GT基因之间通过DNA连接单元以任意顺序连接。


4.根据权利要求3所述的提高获得基因编辑植株概率的筛选系统，其特征在于，所述DNA连接单元为能够转录和翻译成一种带有自切割功能多肽的DNA序列；
优选的，所述DNA连接单元的核苷酸序列包含编码SEQIDNO.4所示2A肽氨基酸序列的核苷酸序列；
进一步优选的，所述DNA连接单元为核苷酸序列如SEQIDNO.8所示的2A1，或核苷酸序列如SEQIDNO.9所示的2A2。


5.根据权利要求1所述的提高获得基因编辑植株概率的筛选系统，其特征在于，所述启动子为能在植物中发挥功能的启动子，所述终止子为能在植物中发挥功能的终止子；
优选的，所述启动子为能在双子叶类植物或单子叶类植物中发挥功能的启动子，所述终止子为能在双子叶类植物或单子叶类植物中发挥功能的终止子；
进一步优选的，所述启动子为能在水稻中发挥功能的启动子，所述终止子为能在水稻中发挥功能的终止子；
更进一步优选的，所述启动子为OsActin1的启动子，所述终止子为tHsp。


6.根据权利要求1所述的提高获得基因编辑植株概率的筛选系统，其特征在于，所述的CRISPR/Cas基因编辑系统包括Cas蛋白表达盒、gRNA转录盒。


7.一种提高获得基因编辑植株概率的筛选系统的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)构建RU...

【专利技术属性】
技术研发人员：和玉兵，占华东，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32