一种氧化葡萄糖酸杆菌中基因抑制的方法技术

本发明专利技术公开了一种氧化葡萄糖酸杆菌中基因抑制的方法，属于基因工程和生物工程技术领域。本发明专利技术将相应靶基因crRNA在氧化葡萄糖酸杆菌中进行表达。通过验证对质粒上mCherry荧光表达的抑制作用，表明重组氧化葡萄糖酸杆菌有基因抑制的作用，并且通过对氧化葡萄糖酸杆菌基因组中的其他基因进行抑制，也达到了类似的抑制效果，进一步证明了此系统对基因组上基因的抑制功能。为在氧化葡萄糖酸杆菌中抑制目的基因提供了一种新方法，能够快速、有效抑制目的基因的表达，提高了对氧化葡萄糖酸杆菌的基因编辑效率。

【技术实现步骤摘要】
一种氧化葡萄糖酸杆菌中基因抑制的方法
本专利技术涉及一种氧化葡萄糖酸杆菌中基因抑制的方法，属于基因工程和生物工程

技术介绍
氧化葡萄糖酸杆菌属是醋酸菌群的一部分，因其能够不完全氧化广泛的碳水化合物和醇类，氧化葡萄糖酸杆菌菌株已被成功应用于食品、医药和化妆品等工业领域，生产如维生素C、米格列醇、二羟基丙酮和葡萄糖酸盐等产品。特别是氧化葡萄糖酸杆菌因能以芳香醇、脂肪醇和5-酮果糖为底物合成调味成分而在食品添加剂和甜味剂的生产中具有重要应用。氧化葡萄糖酸杆菌因没有完整的糖酵解跟柠檬酸循环，其主要的中心碳代谢途径为磷酸戊糖途径与Entner-Doudoroff途径。随着代谢工程及合成生物学的发展，对于氧化葡萄糖酸杆菌的基因工程改造以提升其生产转化能力越来越引起科研工作者的重视。然而，相对于大肠杆菌，酿酒酵母等模式菌株，作为工业菌株的氧化葡萄糖酸杆菌可用的基因操作工具非常有限。目前，仅有少数的穿梭质粒可用，且这些质粒在同一氧化葡萄糖酸杆菌内通常不兼容，限制了质粒游离表达多个基因的可能性。同时，对于氧化葡萄糖酸杆菌基因组的操作工具通常依赖于抗性整合跟利用五氟尿嘧啶反选整合的方法。因氧化葡萄糖酸杆菌对于多种抗生素的天然抗性，抗性整合被严重制约。另外因利用五氟尿嘧啶反选假阳性极多，大大增加了工作量。因此，需要找到一种能够高效、简便的抑制氧化葡萄糖酸杆菌中基因表达的方法，从而推动对于氧化葡萄糖酸杆菌的研究与应用。
技术实现思路
为了解决目前存在的问题，本专利技术通过转化能够转录crRNA的p2-5-pAtse-crRNA(图1)，实现了对氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003基因的抑制，成功在氧化葡萄糖酸杆菌中开发出了基于IE型CRISPR-Cas系统的CRISPRi系统，扩展了氧化葡萄糖酸杆菌中可应用的基因操作工具。本专利技术的第一个目的是提供一种抑制氧化葡萄糖酸杆菌中基因表达的元件，所述元件由crRNA、表达crRNA的启动子和表达载体组成。在本专利技术的一种实施方式中，crRNA由目的基因的spacer序列和其两端的重复序列组成。在本专利技术的一种实施方式中，以p2-5载体为表达载体，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述表达crRNA的启动子为任意能够在氧化葡萄糖酸杆菌中表达的启动子。在本专利技术的一种实施方式中，所述表达crRNA的启动子包括pAtse。在本专利技术的一种实施方式中，所述pAtse的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述氧化葡萄糖酸杆菌为氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003。本专利技术的第二个目的是提供一种抑制氧化葡萄糖酸杆菌中基因表达的方法，利用所述的元件抑制基因的表达。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因包括红色荧光蛋白、Entner-Doudoroff途径关键基因edd和磷酸戊糖途径关键基因gnd。在本专利技术的一种实施方式中，所述edd基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述gnd基因的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法包括以下步骤：(1)选取目的基因PAM序列为AAG的合适位点的32bp序列作为spacer序列；(2)在spacer序列的两端加上重复序列后，与表达载体连接，获得表达载体p2-5-pAtse-crRNA；(3)将p2-5-pAtse-crRNA转化至氧化葡萄糖酸杆菌中。本专利技术还保护所述元件或所述方法在在氧化葡萄糖酸杆菌中抑制基因表达的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术以氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003为宿主，表达一系列重组质粒p2-5-pAtse-crRNA，得到了表达相应靶基因crRNA的重组氧化葡萄糖酸杆菌，利用获得的重组氧化葡萄糖酸杆菌验证了其基因抑制的作用。本专利技术的这种抑制目的基因表达的方法，为在氧化葡萄糖酸杆菌中抑制目的基因提供了一种新方法，能够快速、有效抑制目的基因的表达，提高了对氧化葡萄糖酸杆菌的基因编辑效率。附图说明图1为p2-5-pAtse-crRNA穿梭质粒图谱。图2为mCherry抑制图；(A)：mCherry抑制质粒图，(B)：抑制前后相对荧光水平；-：阴性对照，+：阳性对照，YZmCherry：mCherry抑制菌株。图3为抑制gnd、edd前后相对转录水平；YZedd：edd抑制菌株，YZgnd：gnd抑制菌株。具体实施方式(一)培养基LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L。加入17g/L琼脂粉，以配制LB固体培养基。山梨醇培养基：酵母粉10g/L，山梨醇50g/L。加入17g/L琼脂粉，以配制山梨醇固体培养基。(二)氧化葡萄糖酸杆菌感受态制备(冰上操作)：挑取单菌落接种山梨醇培养基30℃过夜培养，次日10％转接至50mL新液体培养基30℃培养4-6h，发酵液离心弃上清，加入用10％甘油配置的0.1M的预冷氯化钙洗涤一次，4℃离心弃上清，用预冷的10％甘油洗涤两次后每份40uL分装。(三)氧化葡萄糖酸杆菌转化：将2ug质粒加入到40uL感受态中，混匀后加入到预冷的1mm间隙的电转杯中，用Bio-RadMicroPulser进行电转，条件为1.8kV电击5ms。电激完后立即加入1mL冷却山梨醇液体培养基，30℃培养3h后涂布至含有50ug/mL头孢氨苄及50ug/mL卡那霉素的固体山梨醇平板上培养约24h至长出可见菌落。(四)QPCR步骤：以菌株WSH-003作为对照，分别将野生菌株氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003、重组氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003/p2-5-pAtse-crRNAgnd和重组氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003/p2-5-pAtse-crRNAedd的单菌落接种于液体山梨醇培养基，30℃培养12h后转接至50mL新液体山梨醇培养基。取24h样品提取RNA进行QPCR分析。使用来自Omega公司(中国广州)的细菌RNA试剂盒按说明书提取样品的总RNA，并通过Eppendorf公司生物光度计(德国Hamburg)测量浓度。使用Takara公司(中国大连)的试剂盒PrimeScriptTMRTMasterMix(PerfectRealTime)按说明书从总RNA合成cDNA。以16SrRNA基因(QPCR引物：16SrRNA-F：ACCCTTGTCTTTAGTTGCCAGCAC；16SrRNA-R：CCACTGTCACCGCCATTGTAGC)为内标，测定编码6-磷酸葡萄糖酸脱水酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的edd(QPCR引物：edd-F：TCCGCCTTCATCAATCCGAATACG；edd-R：ATCGCCTTCTCATCCACGCAATG)和gnd(QPCR引物：gnd-F：GTCCGTCGTGCAGAAGAACTCTC；gnd-R：TCCTTGGGTCCGCCGTACATC)的表达水平。在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抑制氧化葡萄糖酸杆菌中基因表达的元件，其特征在于，所述元件由crRNA、表达crRNA的启动子和表达载体组成。/n

【技术特征摘要】
1.一种抑制氧化葡萄糖酸杆菌中基因表达的元件，其特征在于，所述元件由crRNA、表达crRNA的启动子和表达载体组成。


2.根据权利要求1所述的元件，其特征在于，以p2-5载体为表达载体。


3.根据权利要求1所述的元件，其特征在于，所述表达crRNA的启动子为任意能够在氧化葡萄糖酸杆菌中表达的启动子。


4.根据权利要求3所述的元件，其特征在于，启动子包括pAtse，pAtse的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。


5.一种抑制氧化葡萄糖酸杆菌中基因表达的方法，其特征在于，将权利要求1～4任一所述的元件转入氧化葡萄糖酸杆菌细胞中得到重组菌，将重组菌培养，实现对氧化葡萄糖酸杆菌中基因的抑制。


6.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：周景文，秦志杰，刘立，陈坚，曾伟主，堵国成，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32