一种优化启动子提高γ-谷氨酰胺转肽酶表达量的方法技术

本发明专利技术公开了一种优化启动子提高γ‑谷氨酰胺转肽酶表达量的方法，属于基因工程领域。本发明专利技术实现了B.pumilus ML413来源的γ‑谷氨酰转肽酶基因在枯草芽孢杆菌168中的高效表达，采用本发明专利技术所提供的优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的启动子，构建的基因工程菌对γ‑谷氨酰转肽酶的表达量，较采用未优化的启动子构建的基因工程菌对γ‑谷氨酰转肽酶的表达量，分别提高了30％、63％。

【技术实现步骤摘要】
一种优化启动子提高γ-谷氨酰胺转肽酶表达量的方法
本专利技术涉及一种优化启动子提高γ-谷氨酰胺转肽酶表达量的方法，属于基因工程领域。
技术介绍
γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyltranspeptidase,γ-GT，EC2.3.2.2)负责催化γ-谷氨酰类化合物的γ-谷氨酰分子转移到其他氨基酸、短肽等受体分子上(转肽反应)或水分子上(水解反应)，广泛存在于哺乳动物和细菌中。γ-谷氨酰转肽酶可以用于临床诊断、催化合成氨基酸衍生物方面、催化合成药物或药物前体、催化合成茶氨酸、谷胱甘肽等，还可以用于改善某些苦味氨基酸的风味。这对于医学、化工行业以及食品的发展意义重大。同时，γ-谷氨酰转肽酶在工业上也用来生产L-茶氨酸，因此γ-谷氨酰转肽酶酶活的提高对于工业生产也具有很大的意义。目前γ-谷氨酰转肽酶的表达多选用大肠杆菌体系，江南大学吴敬教授课题组利用大肠杆菌的分泌型质粒实现了γ-谷氨酰转肽酶蛋白的胞外分泌，但是该大肠杆菌宿主表达体系仍存在一定的安全隐患。专利技术人课题组前期成功在B.subtilis中实现了该蛋白的过量表达，胞外获得可观的蛋白酶含量。上述研究为我们实验提出了要求和思路：生产菌株的绝对安全性和目的蛋白能否在宿主菌中实现胞外分泌。钝齿棒杆菌SDNN403(保藏编号CGMCC0890)是经过多级诱变筛选获得，适用于多种氨基酸高产的安全菌株，具备高效表达外源蛋白的潜力。专利技术人课题组前期利用PXMJ19质粒，实现了B.subtilis168来源的γ-谷氨酰转肽酶基因在C.crenatumSDNN403的表达。同时发现γ-谷氨酰转肽酶蛋白的信号肽片段可以在钝齿棒杆菌中被识别，从而引导该目的蛋白分泌到胞外，胞外γ-谷氨酰转肽酶活力仅为10.31U/mL，并申请了相关专利(申请号201610454875.8)，而一种提高γ-谷氨酰转肽酶表达量的方法(申请号：201610576989.X)中提到以钝齿棒状菌为宿主，并在γ-谷氨酰转肽酶基因后加poly(A/T)尾巴，酶活也仅仅才有20.62U/mL；但是，相比于工业化生产要求，该酶的表达量偏低，会增加上游生产成本。枯草芽孢杆菌不产生致热致敏性蛋白质，是大家公认的食品安全级微生物，其遗传学特性清楚，专利技术人课题组尝试以枯草芽孢杆菌作为宿主，构建可以表达γ-谷氨酰转肽酶的基因工程菌，但是其表达量低，限制了其工业化应用及其发展；因此，迫切需要找到一种可提高γ-谷氨酰转肽酶在枯草芽孢杆菌基因工程菌的表达量的方法。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示。本专利技术还提供了一种表达载体，所述表达载体携带上述启动子。在本专利技术的一种实施方式中，所述表达载体包括目的基因。在本专利技术的一种实施方式中，所述目的基因在启动子的下游。在本专利技术的一种实施方式中，所述目的基因为编码γ-谷氨酰转肽酶的基因。在本专利技术的一种实施方式中，所述载体为pMA5质粒。本专利技术还提供了含有上述启动子或上述表达载体的微生物细胞。在本专利技术的一种实施方式中，所述微生物细胞为枯草芽孢杆菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述微生物细胞为枯草芽孢杆菌168。本专利技术还提供可一种提高基因表达量的方法，所述方法是利用核苷酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示的启动子诱导基因的表达。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因为编码γ-谷氨酰转肽酶的基因。在本专利技术的一种实施方式中，所述γ-谷氨酰转肽酶来源于B.pumilusML413。在本专利技术的一种实施方式中，所述γ-谷氨酰转肽酶的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述γ-谷氨酰转肽酶的核苷酸序列如SEQIDNO.46所示。本专利技术还提供了上述启动子，或上述表达载体，或上述微生物细胞，或上述提高基因表达量的方法在在制备L-茶氨酸中的应用。本专利技术还提供了一种制备L-茶氨酸的方法，所述方法为，将上述的启动子和编码γ-谷氨酰转肽酶的基因的表达载体导入宿主细胞中，构建重组细胞；利用重组细胞转化底物L-谷氨酰胺和乙胺制备得到L-茶氨酸。有益效果：(1)本实验实现了B.pumilusML413来源的γ-谷氨酰转肽酶基因在枯草芽孢杆菌168中的高效表达。(2)采用本专利技术所提供的优化后的启动子构建的基因工程菌对γ-谷氨酰转肽酶的表达量，较采用未优化的启动子构建的基因工程菌对γ-谷氨酰转肽酶的表达量分别提高了30％、63％。(3)本专利技术所采用的宿主细胞为枯草芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌由于不产生致热致敏性蛋白质，是大家公认的食品安全级微生物，并且其遗传学特性清楚，有很多噬菌体和质粒可用作克隆载体；也没有明显的密码子偏好性，而且表达过程不易形成包涵体；此外其表达系统本身具有一套高效的分泌信号肽及分子伴侣，分泌能力强；其生长速度很快，发酵工艺成熟。因此，本专利技术所构建的表达系统不但可以满足工业生产的安全性，而且可以满足工业生产的强度。附图说明图1：含有不同启动子的重组菌发酵得到的胞外粗酶液中γ-谷氨酰转肽酶的酶活。图2：含有不同启动子的重组菌发酵得到的胞外粗酶液中γ-谷氨酰转肽酶的酶活。具体实施方式下述实施例所涉及的载体pMA5购自生物风公司，B.subtilis168感受态细胞、大肠杆菌JM109感受态细胞均购自invitrogen公司。下述实施例中所涉及的培养基如下：发酵培养基：葡萄糖10g/L,胰蛋白胨15g/L，酵母提取物20g/L,MgSO41g/L和K2HPO4·3H2O2g/L，添加卡那霉素(50mg/mL)至终浓度为50μg/mL，调节pH为7.2。LB固体培养基：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L、琼脂20g/L。LB液体培养基：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L。下述实施例中所涉及的检测方法如下：γ-谷氨酰转肽酶酶活测定方法：采用比色法测定，具体方法如下：取培养48h的菌液50mL，于4℃条件下10000r/min离心30min收集上清，上清液中即为目的蛋白。酶活测定方法如下：1mL的标准反应体系中包含100mMtris-Hcl(pH10)，2.5mMγ-L-谷氨酰基-对硝基苯胺一水合物，60mM双甘二肽和5μL适当稀释的酶液。37℃反应15min后添加0.2mL3.5mol的醋酸终止反应，不添加双甘二肽作为对照，410nm处测定吸光度值。通过实验组和对照组的吸光度差值即计算转肽酶活。酶活定义：在37℃反应条件下，每分钟内由γ-L-谷氨酰基-对硝基苯胺一水合物经转肽反应生成生成1μmol对硝基苯胺所需要的酶量定义为一个单位标准酶活。实施例1：γ-谷氨酰转肽酶的重组载体的构建γ-谷氨酰转肽酶ggt基因的获得：化学合成核苷酸序列如SEQIDNO.46所示的γ-谷氨酰转肽酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.启动子，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。/n

【技术特征摘要】
1.启动子，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示。


2.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体携带权利要求1所述启动子。


3.如权利要求2所述的一种表达载体，其特征在于，所述表达载体还包括目的基因，所述目的基因在启动子的下游。


4.如权利要求3所述的一种表达载体，其特征在于，所述表达载体为携带目的基因和权利要求1所述的启动子的pMA5质粒。


5.含有权利要求1所述启动子或权利要求2-4任一所述表达载体的微生物细胞。


6.一种提高基因表达量的方法，其特征在于，所述方法是利用权利要求1所述启动子...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨套伟，饶志明，刘栓英，张显，徐美娟，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32