重组启动子、基因表达盒及其在植物育种中的应用制造技术

本发明专利技术提供一种重组启动子，所述重组启动子由依次串联的FMV启动子和玉米热休克70kDa蛋白内含子(iZmHSP70)组成。本发明专利技术还提供了一种基因表达盒及其在育种中的应用。本发明专利技术利用FMV启动子的特殊性，使用该启动子驱动除草剂基因，使得在特定时期喷施除草剂，能够起到灭杀花粉的效果，从而实现雄性不育。本发明专利技术的重组启动子解决了商业化转化事件使用35S+iZmHsp70启动子在制种过程中影响母本制种产量的问题。

【技术实现步骤摘要】
重组启动子、基因表达盒及其在植物育种中的应用
本专利技术属于涉及分子生物学和植物育种
，具体而言，涉及一种重组启动子、基因表达盒及其在植物育种中的应用。
技术介绍
利用杂交优势是提高农作物产量和改进产品品质的重要措施之一。在生产上利用杂交种时，先要配制大量的杂交种子，而制种又要先通过母本去雄这一关。去雄是一项十分繁重的工作。人工去雄不仅费时耗力，增加种子生产成本；如果去雄不及时、不彻底，还会降低杂交种的质量，影响增产效果。利用植物雄性不育系生产杂种种子是降低杂种种子生产成本，保证杂种纯度、保护知识产权的最有效的方法之一，随着技术的发展国际上已经有通过基因重组使植物获得受化学试剂调控的性状表达，如在申请号为201280032386.3的中国专利申请中，孟山都即申请了通过除草剂调控雄性花粉表达技术方案，但国内却少有相关技术的报道，使类似育种技术为外资企业所垄断，不利于我国育种技术的发展。另一方面，当前用于育种的商业化的启动子为35S+iZmHsp70启动子，其在制种过程中显著影响母本制种产量，因此尚需要改造优化。
技术实现思路
基于上述现状，本专利技术的目的是提供一种重组基因启动子，其可以通过施加草甘膦调控植物花粉的形成和表达，并产生雄性不育系，有望打破外资企业的垄断，推动我国育种技术的发展。本专利技术利用了FMV启动子的特殊性，使用该启动子驱动除草剂基因，使得在特定时期喷施除草剂，能够起到灭杀花粉的效果，从而实现雄性不育。本专利技术一方面提供了一种重组启动子，所述重组启动子由依次串联的FMV启动子和玉米热休克70kDa蛋白内含子(iZmHSP70)组成。在根据本专利技术后个实施方案中，所述重组启动子的核苷酸序列为SEQIDNO：1。优选地，所述重组启动子的5′端和3′端分别连接限制性内切酶的酶切位点序列。更优选地，所述重组启动子的5′端连接有Hindlll酶切位点序列，3′端还连接有Avrll酶切位点序列。添加上述酶切位点以利于连接对应的克隆载体。本专利技术进一步提供了一种用于植物育种的基因表达盒，所述基因表达盒包含上述重组启动子，以及受所述重组启动子调控表达的化学抗性基因序列。在根据本专利技术的一个实施方案中，所述化学抗性基因选自除草剂抗性基因，优选为草甘膦抗性基因EPSPS。本专利技术还提供了一种含有如上述重组启动子的重组载体、重组微生物、转基因细胞系、愈伤组织或植株。本专利技术进一步提供了上述的重组启动子在植物育种中的应用。本专利技术的再一方面提供了一种在转基因植物中诱导雄性不育性的方法，其包括：培育包含如上述的基因表达盒的转基因植物，并在所述转基因植物的雄性生殖组织的发育时期施加有效量的除草剂，从而在所述转基因植物中诱导雄性不育性。优选地，所述转基因植物是玉米。更优选地，其中所述雄性生殖组织的所述发育阶段是选自玉米发育的V3、V4、V5、V6、V7、V8、V9、V10、V11、V12、V13以及V14阶段中的一个或多个阶段。优选为V8和V10中的一种或两个。在根据本专利技术后个实施方案中，其中所述除草剂选自乙酰辅酶A羧化酶抑制剂、乙酰乳酸合成酶抑制剂、光系统II抑制剂、原卟啉原氧化酶抑制剂、4-羟苯基丙酮酸双加氧酶抑制剂、5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶抑制剂、谷氨酰胺合成酶抑制剂或合成生长素中的一种或多种。优选地，所述除草剂是草甘膦，进一步优选地，所述草甘膦的施加量为150-350ml/亩。本专利技术还进一步提供了一种产生杂交种子的方法，其包括：1)在含有上述的基因表达盒的转基因植物的雄性生殖组织发育时期施加有效量的除草剂，从而在所述转基因植物中诱导雄性不育性；2)用来自另一品系的植株的花粉使所述转基因植物受精；3)从所述转基因植物收获杂交种子。优选地，所述转基因植物为玉米。更优选地，其中所述雄性生殖组织的所述发育阶段是选自玉米发育的V3、V4、V5、V6、V7、V8、V9、V10、V11、V12、V13以及V14阶段中的一个或多个阶段。优选为V8和V10中的一种或两个。在根据本专利技术的一个实施方案中，其中所述除草剂选自乙酰辅酶A羧化酶抑制剂、乙酰乳酸合成酶抑制剂、光系统II抑制剂、原卟啉原氧化酶抑制剂、4-羟苯基丙酮酸双加氧酶抑制剂、5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶抑制剂、谷氨酰胺合成酶抑制剂或合成生长素中的一种或多种。优选地，所述除草剂是草甘膦，进一步优选地，所述草甘膦的施加量为150-350ml/亩。本专利技术提供的技术方案具有以下有益效果：1)本专利技术提供的重组启动子利用了FMV启动子的特殊性，使用该启动子驱动除草剂基因，使得在特定时期喷施除草剂，能够起到灭杀花粉的效果，从而实现雄性不育。2)本专利技术提供的重组启动子技术解决了商业化转化事件使用35S+iZmHsp70启动子在制种过程中影响母本制种产量的问题。3)本专利技术提供的重组启动子在植物育种中既能够实现雄性不育制种，相较于35S+iZmHSP70-EPSPS(Mon87427)来说不影响制种产量。附图说明图1为本专利技术的含有pFMV+iZmHSP70-EPSPS核苷酸序列的重组克隆载体LP06-T构建流程图；图2为本专利技术雄性不育载体制备方法：含有pFMV+iZmHSP70-EPSPS核苷酸序列的重组表达载体LP-PT06构建流程图；图3为本专利技术雄性不育载体转化体的PCR检测图，其中WT为野生型植株，PC为质粒对照，NC为水对照，1～15为15个阳性转化体，其中1-5为OsAct-EPSPS转化体、6-10为35S+iZmHSP70-EPSPS转化体和FMV+iZmHSP70-EPSPS转化体。图4不同转化体F1杂交制种产量测定结果图。具体实施方式以下实施例用于说明本申请，但不用来限制本申请的范围。下面将更详细地描述本申请的具体实施例。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本申请，并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的″包含″或″包括″为一开放式用语，故应解释成″包含但不限定于″。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。如无特殊说明，本专利技术中所用到的试剂均可以商购途径购买得到。实施例1pFMV+iZmHSP70等启动子核苷酸序列的获得和合成1、获得pFMV+iZmHSP70核苷酸序列pFMV+iZmHSP70组合启动子的核苷酸序列(1406个核苷酸)，如序列表中SEQIDNO：1所示。2、合成上述pFMV+iZmHSP70核苷酸序列所述pFMV+iZmHSP70核苷酸序列(如序列表中SEQIDNO：1所示)由南京金斯瑞生物科技公司合成；合成的所述pFMV+iZmHSP70核苷酸序列(SEQIDNO：1)的5′端连接有Hindlll酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组启动子，其特征在于，所述重组启动子由依次串联的FMV启动子和玉米热休克70kDa蛋白内含子(iZmHSP70)组成。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组启动子，其特征在于，所述重组启动子由依次串联的FMV启动子和玉米热休克70kDa蛋白内含子(iZmHSP70)组成。


2.如权利要求1所述的重组启动子，其特征在于，所述重组启动子的核苷酸序列为SEQIDNO：1。


3.一种用于植物育种的基因表达盒，其特征在于，所述基因表达盒包括如权利要求1或2所述重组启动子，以及受所述重组启动子调控表达的化学抗性基因序列。


4.如权利要求3所述的基因表达盒，其特征在于，所述化学抗性基因选自除草剂抗性基因。


5.含有如权利要求3或4所述基因表达盒的重组载体、重组微生物、转基因细胞系、愈伤组织或植株。


6.一种在转基因植物中诱导雄性不育性的方法，其特征在于，包括：
培育包含如权利要求3或4所述的基因表达盒的转基因植物，并在所述转基因植物的雄性生殖组织的发育时期施加有效量的除草剂，从而在所述转基因植物中诱导雄性不育性。


7...

【专利技术属性】
技术研发人员：李树秀，李晓娇，贾志伟，吕玉平，孙宇，韩雨颖，邓言赛，贺志豪，卢娟，
申请(专利权)人：隆平生物技术海南有限公司，
类型：发明
国别省市：海南;46