一种通过农杆菌注射技术对石榴幼果子房内胚珠进行转基因的方法及其应用技术

一种通过农杆菌注射技术对石榴幼果子房内胚珠进行转基因的方法及其应用，本发明专利技术在石榴幼果时期，向石榴幼果的子房内注射农杆菌，农杆菌通过与石榴胚珠的充分接触，从而有效地将外源基因导入石榴幼胚细胞内，进一步发育成种子，经筛选检测获得石榴转基因植株。该方案成本低，可以有效地解决石榴转基因育种困难的问题。该发明专利技术直接侵染石榴的幼胚，转化后的幼胚在果实内发育成种子，每个石榴子房内胚珠数量大约在200粒左右，即使转化效率不高，所获得的转化植株的数量也是十分可观的；获得的阳性植株就是F1代，缩短了育种的周期。

【技术实现步骤摘要】
一种通过农杆菌注射技术对石榴幼果子房内胚珠进行转基因的方法及其应用
本方法属于基因工程育种领域，通过使用根癌农杆菌介导技术将外源基因转入野生型石榴并成功表达外源基因相关性状，具体涉及一种石榴子房注射的转基因方法。
技术介绍
石榴(Punicagranatum)为石榴科石榴属植物，全世界的温带和热带都有种植。Lansky等人研究发现石榴的叶、花、果、根等部分，都具有特殊的药理作用。近年来，石榴的栽培及开发利用受到关注。目前石榴育种方法仍然以传统的杂交育种为主，效率低速度慢，难以满足需求。如何通过基因工程手段改变石榴的园艺性状或对石榴中的次生代谢相关基因进行调控，培育人们所需要的石榴品种，从而进一步培育出高产、品质优良的石榴新品种是当前需要解决的问题。目前国内外用于植物转基因的技术手段有农杆菌介导转化法、基因枪法、花粉管通道法、微注射法、电穿孔法、微束激光打孔法等方法，其中农杆菌介导转化法因操作简便、成本较低，最为常用。农杆菌介导转化又分为离体愈伤组织侵染和活体直接侵染，其中离体愈伤组织侵染最为常用，活体直接侵染较为少见，有报道小型本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种通过农杆菌注射技术对石榴幼果子房内胚珠进行转基因的方法，其特征是步骤如下：/n步骤（1）制备农杆菌注射液：无菌操作，将处于对数生长期并携带有目的基因与抗性基因表达载体的根癌农杆菌菌液进行离心收集菌体，将菌体沉淀加入侵染液中，从而获得含有菌体的侵染液；/n步骤（2）注射侵染液：石榴植株上选择子房略微膨大的健康石榴幼果作为实验材料，使用尖头镊去除石榴幼果的花冠以及雄蕊部分，使用酒精棉球对雌蕊基座周围的组织进行充分消毒，使用无菌针灸针在雌蕊基部位置缓慢垂直扎入石榴幼果子房部位，随即取出，切记不可扎伤石榴胎座组织，使用无菌微量注射器在针眼部位浅层处垂直缓慢注入通过（1）制备的根癌农杆菌侵染液，...

【技术特征摘要】
1.一种通过农杆菌注射技术对石榴幼果子房内胚珠进行转基因的方法，其特征是步骤如下：
步骤（1）制备农杆菌注射液：无菌操作，将处于对数生长期并携带有目的基因与抗性基因表达载体的根癌农杆菌菌液进行离心收集菌体，将菌体沉淀加入侵染液中，从而获得含有菌体的侵染液；
步骤（2）注射侵染液：石榴植株上选择子房略微膨大的健康石榴幼果作为实验材料，使用尖头镊去除石榴幼果的花冠以及雄蕊部分，使用酒精棉球对雌蕊基座周围的组织进行充分消毒，使用无菌针灸针在雌蕊基部位置缓慢垂直扎入石榴幼果子房部位，随即取出，切记不可扎伤石榴胎座组织，使用无菌微量注射器在针眼部位浅层处垂直缓慢注入通过（1）制备的根癌农杆菌侵染液，注射体积为50-150µL，注射完毕取下注射器，使用酒精棉球再次轻微擦拭伤口，给整个幼果套上纸袋；
步骤（3）转化效果抽样检测：随机抽取已注射侵染液72小时的石榴幼果，解剖幼果取出胚珠进行GUS染色，观察根癌农杆菌瞬时转化效果；
步骤（4）阳性石榴苗的筛选：待石榴果实完全成熟后，收获健康的石榴种子，经过除菌种植在抗生素抗性的MS固体培养基中，对阳性苗进行筛选，培养温度为28~30℃，光照时间为18h.d-1，光照强度为2000lx，培养30天后获得石榴幼苗，对不同株石榴幼苗进行分子鉴定，从而筛选获得阳性植株。


2.根据权利要求1所述的一种通过农杆菌注射技术对石榴幼果子房内胚珠进行转基因的方法，其特征是所使用的载体为携带β-葡萄糖酸甘酶基因（GUS）与卡那霉素抗性基因的PBI121载体。


3.根据权利要求1所述的一种通过农杆菌注射技术对石榴幼果子房内胚珠进行转基因的方法，其特征是所述的石榴品种为大青皮石榴和大红袍石榴。


4.根据权利要求1所述的一种通过农杆菌注射技术对石榴幼果子房内胚珠进行转基因的方法，其特征是所述的农杆菌为GV3101根癌农杆菌，菌体具备利福平抗生素抗性。


5.根据权利要求1所述的一种通过农杆菌注射技术对石榴幼果子房内胚珠进行转基因的方法，其特征是
农杆菌注射液制备
CRISPRcas9BGK01载体上携带有潮霉素抗性基因（HYG）与卡那霉素抗性基因（KaNa），使用酶切法将石榴葡萄糖醛酸脱羧酶基因（UDP-glucuronicaciddecarboxylase5）部分外显子序列插入到BGK01载体的多克隆位点上，从而构建石榴葡萄糖醛酸脱羧酶基因BGK01载体，将构建完毕的载体转入GV3101根癌农杆菌感受态细胞中，从而获得目的菌种；
将该菌种在加入双抗的LB液体培养基中摇菌扩繁，随后离心收集菌体，菌体加入侵染液中，侵染液中菌体浓度为OD600=1.0，静置3h后使用；
侵染液配方为：每300mL去离子水中加入MgCl20.2856g，MES0.63g，随后使用封口膜封口，放入高温高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌，灭菌条件为121℃，20分钟，灭菌完毕冷凉至室温，在无菌台上加入AS11.772mg（AS使用DMSO进行溶解，通过0.22µm有机相滤头进行无菌过滤）；
配制LB液体抗性培养基：每100mL蒸馏水中加入胰蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，NaCl1g，随后将培养基用封口膜封口，放入高温高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌，灭菌条件为121℃，20分钟，灭菌完毕冷凉至室温，在无菌台上加入过滤好的卡那霉素与利福平抗生素，抗生素在培养基中的浓度为50mg.L-1；
（2）注射农杆菌
在果园石榴植株上挑选子房膨大且直径在1.5cm以内的健康石榴幼果作为实验材料，使用尖头镊去除石榴幼果的花冠以及雄蕊部分，使用沾有75%乙醇的脱脂棉对雌蕊基座周围的组织进行充分擦拭，以尽量清除细菌与真菌孢子，使用直径0.16mm的针灸针在雌蕊基部位置缓慢垂直扎入石榴幼果子房部位，随即取出，切记不可扎伤石榴胎座组织，使用1mL微量注射器在针眼部位浅层处垂直缓慢注入根癌农杆菌侵染液，注射体积为100-150µL，注射完毕取下注射器，使用酒精棉球再次轻微擦拭伤口，并给整个幼果套上纸袋；
（3）鉴定突变体石榴
九月中旬收获成熟的石榴种子，去掉外种皮，使用75%乙醇对种子进行消毒，随即种植在HYG抗性的MS固体培养基中（HYG在MS固体培养基中的浓度为20mg.L-1，并已通过0.22µm水相滤头过滤），用消毒的剪刀剪取石榴幼苗植株1cm2面积真叶，使用CTAB法提取该真叶中的基因组DNA作为模板，对靶基因位点的外显子序列设计前后引物，使用Taq酶mix共同构建PCR体系，以扩增靶位点外显子全长序列，并将扩增结果进行测序，从而筛选阳性植株；对筛选到的阳性植株进行靶基因的半定...

【专利技术属性】
技术研发人员：张立华，任宏伟，
申请(专利权)人：枣庄学院，
类型：发明
国别省市：山东;37