提高颠茄中托品烷生物碱含量的方法技术

本发明专利技术公开了提高颠茄中托品烷生物碱含量的方法,通过在颠茄中表达rolC基因或rolB有效提升TAs生物碱合成途径基因表达量，提高颠茄中的莨菪碱和山莨菪碱的含量，但会对植株表型产生变异影响；而H6H‑p组织定位表达的rolC基因rolB基因，在提高生物碱的同时，不影响植株表型生长。通过对rolC基因或rolB基因的选择控制，为进一步在颠茄的药用领域培育出高产生物碱颠茄株系奠定基础，并为进一步开展颠茄的TAs生物碱基因工程代谢研究提供一种新的方法。

【技术实现步骤摘要】
提高颠茄中托品烷生物碱含量的方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及提高颠茄中托品烷生物碱含量的方法。
技术介绍
托品烷生物碱(Tropanealkaloids,TAs)是在临床上常用的一类抗胆碱药物，在镇痛、麻醉、抗晕动病、戒毒、帕金森氏病、农药中毒等治疗方面有良好的作用。目前托品烷生物碱主要从天然植物颠茄(Atropabelladonna)、曼陀罗(Daturastramonium)、山莨菪(Anisodustanguticus)等植物中提取，市场需求巨大，工业合成的成本较高。颠茄是被中国药典收录，主要提供托品烷生物碱的商业药源植物。2015版药典要求颠茄干草中莨菪碱含量不得低于0.3％，而野生颠茄中莨菪碱含量大约仅为干重的0.02％-0.17％，东莨菪碱含量更低，约为0.01％-0.08％，山莨菪碱含量更加微弱。因此利用代谢工程技术提高植株中的TAs含量是目前培育高产优质药源植物的一个最有效的方法。并且随着对TAs代谢途径的深入研究及基因克隆和高效遗传转化系统的发展，利用遗传代谢工程手段在植物细胞中大量生产高附加值的次生代谢产物已成为目前的研究方向和热点。rol基因是发根农杆菌中pRi质粒上的植物发根诱导基因。White等(WhiteFFetal，1985)通过对发根农杆菌pRiA4的T-DNA进行插入和缺失诱变实验，发现TL-DNA至少包含四个与发根诱导相关的基因位点，分别给它们命名为rol(rootloci)A、rolB、rolC和rolD基因。研究发现，发根农杆菌rol基因诱导产生的植物发根往往能合成比植物体本身更高水平的次生代谢产物。在青蒿中报道，转rolB基因的青蒿显示青蒿素提升9倍，而转rolC基因的青蒿素提高了4倍。rol基因虽能在根中可促进次生代谢产物的合成，但在地上部分却有诱发植物畸形发育的副作用，Ooms等(OomsG，1985)研究发现，尽管用Ri质粒转化的甘蓝型油菜可以开花，但不能结出种子。因此，有必要探索如何在颠茄中保留rol基因在植株中有利的一面。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种提高颠茄中托品烷生物碱含量的方法。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：提高颠茄中托品烷生物碱含量的方法，通过在颠茄中表达农杆菌rolC或rolB基因，所述农杆菌rolC基因的序列如SEQIDNO.8所示；所述农杆菌rolB基因的序列如SEQIDNO.9所示。本专利技术中，在颠茄中过量表达农杆菌rolC基因或rolB基因的方法如下：克隆农杆菌rolC基因或rolB基因，然后构建植物表达载体，获得含有农杆菌rolC基因或rolB基因的重组植物表达载体，再将获得的重组植物表达载体转化根癌农杆菌获得工程菌，最后用工程菌转化颠茄，筛选转基因阳性植株，获得托品烷生物碱含量提高的颠茄。本专利技术中，所述克隆农杆菌rolC基因的方法为以C58C1菌液为模板，以SEQIDNO.3与SEQIDNO.4或SEQIDNO.5与SEQIDNO.6为引物对进行PCR扩增获得。本专利技术中，所述克隆农杆菌rolB基因的方法为以C58C1菌液为模板，以SEQIDNO.10与SEQIDNO.11为引物对进行PCR扩增获得。本专利技术优选的，所述植物表达载体由农杆菌rolC基因或rolB基因通过BamHI和SacI连入pBI121载体获得。本专利技术优选的，通过在颠茄根中定位表达农杆菌rolC基因或rolB基因。本专利技术优选的，所述通过在颠茄根中定位表达农杆菌rolC基因或rolB基因的方法是克隆农杆菌rolC基因或rolB基因，然后构建rolC基因或rolB基因定位表达载体，再将获得的rolC基因或rolB基因定位表达载体转化根癌农杆菌获得工程菌，最后用工程菌转化颠茄，筛选转基因阳性植株，获得托品烷生物碱含量提高的颠茄。本专利技术优选的，rolC基因根中定位表达载体由以下方法构建：将H6H-p通过HindIII和BamHI连入pBI121载体上，获得pBI121-pH6H-p-GUS载体，然后将pBI121-pH6H-p-GUS载体经BamHI和SacI酶切后连入经同样酶切的农杆菌rolC基因，获得rolC基因定位表达载体pH6H-p-rolC；所述H6H-p基因的序列如SEQIDNO.7所示。本专利技术优选的，rolB基因根中定位表达载体由以下方法构建：将H6H-p通过HindIII和BamHI连入pBI121载体上，获得pBI121-pH6H-p-GUS载体，然后将pBI121-pH6H-p-GUS载体经BamHI和SacI酶切后连入经同样酶切的农杆菌rolB基因，获得rolB基因定位表达载体pH6H-p-rolB；所述H6H-p基因的序列如SEQIDNO.7所示。本专利技术的有益效果在于：本专利技术在颠茄中表达rolC基因或rolB基因能有效提升TAs生物碱合成途径基因表达量，并且提高颠茄中的莨菪碱和山莨菪碱的含量，但会对植株表型产生变异影响；进一步通过H6H-p组织定位表达rolC基因或rolB基因，在提高生物碱的同时，不影响植株表型生长。实现对rol基因的选择控制，为进一步在颠茄的药用领域培育出高产生物碱颠茄株系，并进一步开展颠茄的TAs生物碱基因工程代谢研究提供一种新的方法。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：图1为颠茄遗传转化图(A：颠茄种子萌发第15d；B：第28d颠茄下胚轴快繁丛生芽；C：第30d颠茄子叶快繁丛生芽；D：颠茄转基因植株生根培养；E：室内练苗；F：室外种植转基因植株)；图2为对照与CaMV35S-rolC转基因颠茄组培瓶时期的表型图(A1、A2、A3：WT颠茄第30d根部、顶芽、叶、茎段节间；B1、B2、B3：转pBI121空载颠茄30d根部、顶芽、叶、茎段节间；C1、C2、C3：EHA105-pCaMV35S-rolC第30d根部、顶芽、叶、茎段节间)；图3为室内生长的CaMV35S-rolC转基因颠茄叶表型观察(A、E：野生型WT；B、F：空载转基因；C、D：AbEHA105-pCaMV35S-rolC转基因苗)。图4为室外生长的CaMV35S-rolC转基因颠茄表型观察(A、E：野生型WT；B、F：空载转基因；C、D、G、H：EHA105-pCaMV35S-rolC转基因苗)。图5为EHA105-pH6H-p-rolC转基因苗表型生长(WT：1号；no-loadtransgene：2号；EHA105-pH6H-p-rolC转基因苗：3号、4号)。图6为莨菪碱和东莨菪碱标准曲线(A：莨菪碱；B：东莨菪碱)。图7为生长2月颠茄中山莨菪碱含量(WT：野生型颠茄；PBI121：空载体转基因颠茄；C系列：CaMV35S-rolC转基因颠茄)。图8为生长2月颠茄中莨菪碱含量(WT：野生型颠茄；PBI121：空载体转基因颠茄；C系列：CaMV35S-rolC转基因颠茄)。图9为生长2月颠茄中山莨菪碱含量(WT：野本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.提高颠茄中托品烷生物碱含量的方法，其特征在于：通过在颠茄中表达农杆菌rolC或rolB基因，所述农杆菌rolC基因的序列如SEQ ID NO.8所示；所述农杆菌rolB基因的序列如SEQ ID NO.9所示。/n

【技术特征摘要】
1.提高颠茄中托品烷生物碱含量的方法，其特征在于：通过在颠茄中表达农杆菌rolC或rolB基因，所述农杆菌rolC基因的序列如SEQIDNO.8所示；所述农杆菌rolB基因的序列如SEQIDNO.9所示。


2.根据权利要求1所述提高颠茄中托品烷生物碱含量的方法，其特征在于：在颠茄中过量表达农杆菌rolC基因或rolB基因的方法如下：克隆农杆菌rolC基因或rolB基因，然后构建植物表达载体，获得含有农杆菌rolC基因或rolB基因的重组植物表达载体，再将获得的重组植物表达载体转化根癌农杆菌获得工程菌，最后用工程菌转化颠茄，筛选转基因阳性植株，获得托品烷生物碱含量提高的颠茄。


3.根据权利要求2所述提高颠茄中托品烷生物碱含量的方法，其特征在于：所述克隆农杆菌rolC基因的方法为以C58C1菌液为模板，以SEQIDNO.3与SEQIDNO.4或SEQIDNO.5与SEQIDNO.6为引物对进行PCR扩增获得。


4.根据权利要求2所述提高颠茄中托品烷生物碱含量的方法，其特征在于：所述克隆农杆菌rolB基因的方法为以C58C1菌液为模板，以SEQIDNO.10与SEQIDNO.11为引物对进行PCR扩增获得。


5.根据权利要求2所述提高颠茄中托品烷生物碱含量的方法，其特征在于：所述植物表达载体由农杆菌rolC基因或rolB基因通过BamHI和SacI连入pBI121载体获得。


6.根据权利要求1所述提高颠茄中托品烷生物碱含量的方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：强玮，廖志华，张明生，付维，路星星，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：贵州;52