一种利用CRISPR/Cas9定向编辑结球甘蓝基因的方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种利用CRISPR/Cas9定向编辑结球甘蓝基因的方法及应用，属于生物技术领域。该方法包括以结球甘蓝BoGASA基因序列为参照设计sgRNA、构建BoGASA基因的sgRNA载体、重组质粒转化农杆菌、农杆菌介导结球甘蓝带柄子叶遗传转化及转化植株的分子检测，在此基础上建立了一套完整的结球甘蓝基因编辑技术体系，对于结球甘蓝反向遗传学研究的开展和其他十字花科植物基因功能解析具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种利用CRISPR/Cas9定向编辑结球甘蓝基因的方法及应用
本专利技术涉及生物技术
，具体涉及一种利用CRISPR/Cas9定向编辑结球甘蓝基因的方法及应用。
技术介绍
结球甘蓝(BrassicaoleraceaL.var.capitataL.)，属十字花科芸苔属作物，为甘蓝(BrassicaoleraceaL.)的变种，全国各地普遍种植，是我国重要蔬菜之一。随着高通量测序技术的快速发展，结球甘蓝基因组数据的公开，急需一种有效的分子生物学手段对大量的功能未知基因进行解析。相比于水稻、拟南芥、番茄等模式植物，多数的园艺植物缺乏有效的再生体系和遗传转化体系，严重阻碍园艺植物基因功能研究。CRISPR/Cas9基因编辑技术的出现为结球甘蓝基因功能研究提供了便利的方法。该系统最先在细菌和古菌中发现，是细菌和古菌用来切割外源核酸，抵御外来病毒侵染的武器。II型CRISPR/Cas系统经过改造之后可用于定向基因编辑，通过sgRNA引导Cas9蛋白靶向切割导致DNA双链断裂，触发非同源重组末端连接修复机制，实现基因突变。与ZFN，TALEN本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用CRISPR/Cas9定向编辑结球甘蓝基因的方法，其特征在于BoGASA基因在结球甘蓝的基因编辑中的应用，包括以下步骤：/n(1)引物设计和配对：将设计好的正、反向引物、ddH

【技术特征摘要】
1.一种利用CRISPR/Cas9定向编辑结球甘蓝基因的方法，其特征在于BoGASA基因在结球甘蓝的基因编辑中的应用，包括以下步骤：
(1)引物设计和配对：将设计好的正、反向引物、ddH2O、连接酶、多核苷酸激酶配制反应液，再经配对处理得反应产物；
其中，所述正向引物序列为BoGASA-F：5’-GATTGCTTCCTCACCTCACACAGAA-3’，SEQIDNO.1；
所述反向引物序列为BoGASA-R：5’-AAACTTCTGTGTGAGGTGAGGAAGC-3’，SEQIDNO.2；
(2)质粒酶切：将psgR-Cas9-At质粒酶切回收得线性质粒；
(3)连接：将步骤(1)的反应产物、步骤(2)得到的线性质粒连接，得重组质粒；
(4)酶切、连接与转化：将步骤(3)中得到的重组质粒采用HindIII和KpnI进行双酶切，得到的sgRNA-Cas9片段和线性化的pCAMBIA1301连接，得到pCAMBIA1301-sgRNA-Cas9；
(5)遗传转化：用含有步骤(4)质粒pCAMBIA1301-sgRNA-Cas9的菌液侵染外植体，培养至完整植株；
(6)基因编辑植株检测：提取编辑植株叶片DNA为模板，进行PCR扩增和序列检测。


2.根据权利要求1所述的一种利用CRISPR/Cas9定向编辑结球甘蓝基因的方法，其特征在于，步骤(1)具体为：取100μM正向引物1μL，100μM反向引物1μL，1μL10×T4DNA连接酶缓冲液，6.5μLddH2O，10U/μLT4多核苷酸激酶0.5μL，配制成10μL反应液，在37℃30min，95℃5min，然后以0.2℃/s降温至25℃；反应产物用ddH2O稀释备用。


3.根据权利要求2所述的一种利用CRISPR/Cas9定向编辑结球甘蓝基因的方法，其特征在于，步骤(2)酶切酶为BbsI，酶切体系如下：20μLpsgR-Cas9-At，10U/μLBbsI1μL，10U/μL牛小肠碱性磷酸酶1μL，4μL10×NEBuffer2.1，14μLddH2O。


4.根据权利要求3所述的一种利用CRISPR/Cas9定向编辑结球甘蓝基因的方法，其特征在于，步骤(3)具体为：取1μL步骤(2)得到线性质粒，1μL步骤(1)得到的反应产物，1μL10×T4DNA连接酶缓冲液，400U/μLT4DNA连接酶1μL，6μLddH2O，连接过夜，将得到的重组质粒转化大肠杆菌，在100μg/mL氨苄青霉素的麦康凯琼脂培养基上继续培养。

【专利技术属性】
技术研发人员：王神云，余方伟，王红，张伟，李建斌，于利，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，南京利华农业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32