一种用于诊断泡型棘球蚴病的串联蛋白及其克隆表达方法技术

本发明专利技术公开了一种用于诊断泡型棘球蚴病的串联蛋白及其克隆表达方法，该串联蛋白由EmAgB3基因和Em18基因通过GGGS串联后，转化E.coli并诱导表达的，串联后的蛋白，其分子量比原有蛋白增大了许多，随之抗原性也得到了增强。这为建立更加敏感和特异的血清学诊断方法、疫苗的研制和免疫预防奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种用于诊断泡型棘球蚴病的串联蛋白及其克隆表达方法
本专利技术涉及基因工程领域及蛋白质组学领域，具体为一种用于诊断泡型棘球蚴病的串联蛋白及其克隆表达方法。
技术介绍
泡型棘球蚴病（Alveolarechinococcosis,AE）是由多房棘球绦虫（Echinococcusmultilocularis,Em）的续绦期幼虫感染引起的一种人畜共患寄生性蠕虫疾病。该病在中国、日本、俄罗斯、中亚和北美部分地区流行严重。根治性肝切除手术是目前唯一比较可靠的治疗方法。因此，AE早期免疫诊断是降低本病死亡率的关键要求。对AE进行早期诊断并采取及时措施，可显著降低因AE造成的低死亡率。目前，对于该病的诊断，尤其是确诊该病，还主要依赖于病原学及影像学诊断。但影像学诊断需要影像学背景知识，操作复杂，却又不易识别较小和非典型的病灶，尤其又不易与脓肿或肿瘤进行区别当前，基于纯化的天然抗原Em2的酶联免疫吸附试验（Em2-ELISA）的诊断方法已被世界卫生组织推荐用于AE的血清诊断。
技术实现思路
本专利技术的目的一在于提供一种用于诊断泡型棘球蚴病的串联蛋白。本专利技术提供的串联蛋白为EscherichiacolipET28a-BL21(DE3)/01/EmAgB3-GGGS-Em18（以下简称为EmAgB3-GGGS-Em18），该蛋白现保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO:M2019622，保藏日期2019年8月12日。Em18是AE的一个新的蛋白质表位，具有显著的抗体反应性，Em18通过免疫印迹很容易就被检测到，是一种良好的血清学标记标签，可用于与其它寄生虫病的鉴别，其也可以鉴别活动期和非活动期AE的鉴别。EmAgB3抗原的同种型针对活动期AE的患者血清的特异性免疫反应性，克隆该基因并进行细菌的原核表达（rEmAgB3），免疫印迹表明，该蛋白的敏感性和特异性分别为90.9％（80/88）和98.5％（597/606），表明EmAgB3可适用于血清学诊断和AE的随访监测。且rEmAgB3的使用具有简易性和高重复性，可能适用于AE患者的临床诊断和流行区域的大规模流行病学调查。鉴于EmAgB3和Em18两个蛋白质良好的免疫原性，且为了增加蛋白的抗原性，利用一个linker蛋白GGGS，将这两个蛋白进行了串联表达，以提高对AE的检测率。本专利技术的目的二，是提供一种串联蛋白EmAgB3-GGGS-Em18的克隆表达方法，具体步骤如下：（1）扩增EmAgB3和Em18基因：扩增EmAgB3基因，其中上游引物引入BamHI酶切位点，下游引物引入HindIII酶切位点，引物序列如下：EmAgB3F：5´-CGGATCCGATGATGATGAAGTGACC-3´；EmAgB3R：5´-CAAGCTTCTACTCATCCTCTTTAAT-3´；扩增Em18基因，其中上下游引物引入BamHI酶切位点，引物序列如下：Em18F：5´-GGATCCGAAGGAGTCTGACTTAGCGGAT-3´；Em18R：5´-GGATCCTATTTGAGGTTGGCCAGCTTCGT-3´。（2）EmAgB3-GGGS-Em18的基因合成：根据EmAgB3和Em18的基因序列，在其上游加上NdeI酶切位点，在其下游加上XhoI酶切位点的序列进行生物合成，并在EmAgB3和Em18之间加上连接蛋白GGGS蛋白。（3）载体酶切：将表达载体PET28a分别进行双酶切，酶切体系为：pET28a1μg，10×FDBuffer5μL，NdeI1μL(10U/μL)，XhoI1μL(10U/μL)，ddH2O42μL；（4）目的片段与载体连接：将回收纯化好EmAgB3-GGGS-Em18DNA片段分别与线性化的pET28a载体进行连接，连接体系为：2×SeamlesscloningMasterMix10μL，线性pGEX-6P-1/pET28a3μL，EmAgB3/EmAgB3-GGGS-Em185μL，SterilizedddH2O2μL；（5）转化E.coliDH5α感受态细胞后筛选克隆：将上述连接液转化E.coliDH5α感受态细胞中，检测筛选出阳性克隆测序鉴定后，扩繁并提取重组pET28a质粒载体；（6）诱导表达融合蛋白：取1uL鉴定重组后的pGEX-6P-1/pET28a载体转化BL21（DE3），将培养的菌液按1:100比例接种于2L含有相应种类和浓度抗生素的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养，当OD值达到0.6时，添加终浓度为0.5mMIPTG，20℃，220rpm，诱导过夜，离心收集细胞菌体；（7）蛋白的纯化：超声破碎菌体，采用镍琼脂糖亲和层析纯化重组EmAgB3-GGGS-Em18。本专利技术提供的技术方案本研究通过生物工程技术，借助一个linker蛋白GGGS，将EmAgB3蛋白和Em18蛋白进行了串联表达，获得了融合蛋白EmAgB3-GGGS-Em18。通过上述方法克隆纯化后的融合蛋白EmAgB3-GGGS-Em18浓度为0.5mg/mL。串联后的蛋白，其分子量比原有蛋白增大了许多，随之抗原性也得到了增强。这为建立更加敏感和特异的血清学诊断方法、疫苗的研制和免疫预防奠定了基础。保藏说明：培养物名称：EscherichiacolipET28a-BL21(DE3)/01/EmAgB3-GGGS-Em18保藏机构：中国典型培养物保藏中心保藏机构简称：CCTCC地址：中国湖北省武汉市武汉大学保藏日期：2019年8月12日保藏中心登记入册编号：CCTCCNO:M2019622。具体实施方式下面结合具体实施实例对本专利技术进行详细说明。以下实施实例有助于此领域的技术人员进一步理解本专利技术，但不以任何形式限制本专利技术。下述实施例中使用的Em青海田鼠分离株由本实验室田间分离鉴定并保存。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1EmAgB3及Em18基因的克隆及序列测定。采用EasyPureRNAKitRNA提取试剂盒提取保存的原头蚴的总RNA，QIAampDNAMinikitDNA提取原头蚴的基因组DNA作为模板分别用于扩增EmAgB3和Em18基因。（1）EmAgB3基因的扩增利用EasyScript®One-StepRT-PCRSuperMixRT-PCR扩增试剂盒扩增EmAgB3基因。反应体系为：PCR反应总体积为20μL，其中包含2μL的模板RNA、各0.5μL浓度为10μM的上下游引物（EmAgB3F、EmAgB3R）、10μL的2×One-StepReactionMix、0.5μLEasyScriptOne-StepEnzymeMix、6.5μLddH2O。反应条件为：45℃反转录30min，95℃预变性3min，接着进行45本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种串联蛋白EmAgB3-GGGS-Em18，其特征在于所述串联蛋白保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO: M 2019622。/n

【技术特征摘要】
1.一种串联蛋白EmAgB3-GGGS-Em18，其特征在于所述串联蛋白保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO:M2019622。


2.根据权利要求1所述的一种串联蛋白EmAgB3-GGGS-Em18，其特征在于所述串联蛋白用于诊断泡型棘球蚴病。


3.一种权利要求1或2所述的串联蛋白EmAgB3-GGGS-Em18的克隆表达方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：
（1）扩增EmAgB3和Em18基因：
扩增EmAgB3基因，其中上游引物引入BamHI酶切位点，下游引物引入HindIII酶切位点，引物序列如下：
EmAgB3F：5´-CGGATCCGATGATGATGAAGTGACC-3´；
EmAgB3R：5´-CAAGCTTCTACTCATCCTCTTTAAT-3´；
扩增Em18基因，其中上下游引物引入BamHI酶切位点，引物序列如下：
Em18F：5´-GGATCCGAAGGAGTCTGACTTAGCGGAT-3´；
Em18R：5´-GGATCCTATTTGAGGTTGGCCAGCTTCGT-3´；
（2）EmAgB3-GGGS-Em18的基因合成：
根据EmAgB3和Em18的基因序列，在其上游加上NdeI酶切位点，在其下游加上XhoI酶切位点的序列进行生物合成，并在EmAgB3和E...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡其刚，韩秀敏，
申请(专利权)人：青海省畜牧兽医科学院，青海省人民医院，
类型：发明
国别省市：青海;63