用于具有共焦激发平面的广视场多光子显微的方法及系统技术方案

一种广视场显微镜，包括固定其内有荧光材料的样品的平台（５０），产生基本平行的激发光束（２５）的多光子激发光源（１０），该基本平行的激发光束（２５）具有的单光子能量低于该荧光材料的单光子激发所需的吸收能量。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术一般涉及荧光显微术，具体地涉及在共焦平面提供广视场多光子激发。
技术介绍
光学显微术一直被用来检查太小而用肉眼无法清楚地看到的物体。光学显微术包括提供入射光束到样品上并通过放大镜观察来自该样品的光。荧光显微术是另一种类型的显微术，其中用荧光材料标记感兴趣的样品，然后用一定的波长光照射样品，该波长光提供的单光子能级足以激发荧光材料发出发射光。通过收集发射光而不是激发光来检测样品的图像。荧光显微术可实施作为标准的广视场显微术或共焦显微术。在广视场荧光显微术中，诸如弧光灯的激发光源提供平行或准平行的激发光束，该激发光束被会聚到样品的预期焦平面上。焦平面处的图像由所有由特定物镜的点扩散特性包围的光产生。因为点扩散函数不能确定单个焦平面，所以荧光材料的激发发生在预期焦平面之上和之下，并且不能分辨出样品的卷信息。可以采用通常称为解卷积显微术的计算方法，来从在不同焦平面处获得的一堆图像中计算样品内特定平面的光，该计算方法利用物镜的点扩散函数的一种模型。这可以通过说明来自每个片段的光对其它片段的影响，从而近似一个规定厚度的共焦图像片段这样的方式完成。广视场解卷积共焦荧光显微术的实施类似于光学共焦显微镜法，然而在许多情况下，由于背景发射导致的差对比度所产生的图像噪声的影响，或由于在实际试验条件下，用于物镜的点扩散函数可能偏离它的相应模型，因此结果得到的图像发生失真。而且，这些问题使得难于构造样品的3-D再现。在共焦荧光显微术中，激发光束被聚焦在样品的焦点。在激发光具有的波长足以提供荧光材料的单光子激发的情况下，激发发生在以焦点为中心的砂漏束腰中，该砂漏束腰近似于物镜的点扩散函数。但是，与广视场荧光显微术不同，通过对激发源和发射图像使用塞孔，可以获得共焦。由于只有来源于焦平面的平行光线才可以穿过塞孔，因此不具有平行光线(或焦平面之外)的光子会被该塞孔阻挡，不能到达探测器。因此，该塞孔阻挡了来自焦点之上和之下的发射光，从而可以提供不被焦平面之上和之下的信息失真的清晰图像。但是，由于发射针孔提供的是仅来自于激光束焦点的图像数据，因此必须在样品上面沿着x和y方向光栅扫描共焦系统的激发激光束，而且必须在每个x，y位置收集荧光发射的强度。从该数据，可在计算机中构造样品的图像片段。通过改变焦平面，可以获得几个图像，并且可在计算机中重新构造获得的图像堆，以获得样品的三维(3-D)再现。广视场和共焦荧光显微术存在的一个共同问题是荧光材料的单光子激发发生在数据图像被实际收集所处的焦点之上和之下。这种不必要的激发将导致特定焦平面之上和之下的材料出现“漂白”，当该特定焦平面随后作为新焦平面的一部分被激发时，该特定焦平面将具有降低的发射特性。而且，位于焦平面之上和之下的组织的反复激发可能会损伤该组织，这对于活样品的图像生成是特别不希望的。近年来，出现了一种用于减少漂白和组织损伤问题的新光学切片技术--多光子荧光显微术。这种类型的显微术使用的是具有比激发荧光材料所需波长更长波长的脉冲照明光源。例如，需要500nm激发波长的染料将用在1000nm工作的激光源照明，使得由于染料在1000nm不吸收光，样品中不产生单光子激发。但是，使用脉冲高功率激发激光器可以在焦点处提供足够高的光子强度，使得至少两个光子被荧光材料(基本同时地)吸收。这种长波长的双光子吸收提供的激发能量等于较短波长的单光子吸收，并致使激发局限在焦点处。因此，利用多光子激发，围绕着焦点的荧光材料将不被激发，从而消除了对塞孔的需要，并将因反复激发而产生的漂白和组织损伤问题减至最小。图6示出了美国专利No.5,034,613中公开的多光子扫描显微系统。如图中所示，扫描显微镜10包括聚焦诸如激光器的光源16产生的入射光14到物面18的物镜12。由入射光束14提供的照明充满通常用24表示的会聚圆锥，该圆锥进入样品以到达在物面18处的焦平面并形成焦点26。从激光器16到物面18的光路径包括激光器16产生的光直接入射到其上的分色镜28。分光镜28向下偏转该光到达反射镜30，反射镜30接着通过曲面反射镜36和38将该光引导到一对扫描反射镜32和34。反射镜32和34可绕相互垂直的轴旋转，以便沿垂直的X和Y轴在物面上移动入射光14，因此利用入射光束可以扫描固定的样品。来自扫描反射镜的光穿过目镜40，通过物镜12聚焦到物面18。由物面18中样品产生的荧光通过显微镜10传回，返回入射光束14的光路径，并因此穿过物镜12和目镜40，扫描反射镜34和32以及曲面反射镜38和36，并且被反射镜30反射回分光镜28。样品中荧光材料发射的光是包含在该样品中的荧光团的特定波长，因此能够穿过分色镜28而不被向激光器16反射回来，并沿着通常以44表示的光路径传播。荧光42因此穿过阻挡滤光器46并被平面反射镜48，50和52反射到诸如光电倍增管54的适当探测器。虽然不为多光子显微术所需要，但在收集光学系统44中可以设置可调的共焦针孔56，以将焦平面之上和之下的会聚和发散锥体内发出激发的背景荧光减至最少。
技术实现思路
尽管多光子荧光显微系统具有上述优点，但是本专利技术人发现这种类型的现有系统包括诸如图8中所示的复杂和昂贵的激发光束扫描机构。而且，对焦点激发光束的扫描通常会导致图像获取速度对于视频速率而言太慢，而对于样品成像而言又太高。因此，本专利技术的一个目的是消除现有技术的多光子荧光显微术存在的上述问题。本专利技术的另一目的是提供一种多光子显微术的方法及系统，其中可以减少或消除激发光源在样品上的扫描。本专利技术的再一个目的是减少样品的图像获取时间。这些和/或其它目的将通过用于具有共焦平面的广视场多光子显微术的方法及系统来提供。根据专利技术的一个方面，广视场显微镜包括配置成固定其内有荧光材料的样品的平台，和配置成产生基本平行的激发光束的多光子激发光源，该基本平行的激发光束具有的单光子能量低于在样品内包含的荧光材料的单光子激发所需的吸收能量。无限校正物镜被光学耦合到该多光子激发光源，并被配置成聚焦基本平行的激发光束到样品上，以便荧光材料的多光子激发同时在样品的预定区域上发生。聚焦透镜被配置成将从该样品的该预定区域发出的发射光同时聚焦到图像探测器的至少两个像素上。根据另一方面，广视场显微镜包括固定其内有荧光材料的样品的装置，和产生基本平行的激发光束的装置，该基本平行的激发光束具有的单光子能量低于在该样品内包含的荧光材料的单光子激发所需的吸收能量。该方面还包括光学耦合到多光子激发光源的装置，其用于接收基本平行的激发光束并将该激发光聚焦到样品上，以便荧光材料的多光子激发同时在样品的预定区域上发生。将从该样品的该预定区域发出的发射光同时聚焦到图像探测器的至少两个像素上的装置。本专利技术的另一个方面包括横跨一共焦平面提供广视场激发的方法。该方法包括固定其内有荧光材料的样品，产生基本平行的激发光束，该基本平行的激发光束具有的单光子能量低于在样品内包括的荧光材料的单光子激发所需的吸收能量，并施加基本平行的激发光束到无限校正物镜，该无限校正物镜聚焦该激发光到该样品上，以便在该样品的预定区域上同时发生荧光材料的多光子激发。将从该样品的该预定区域发出的发射光同时聚焦到图像探测器的至少两个像素上。本专利技术的再一个方面包括具有广视场显微镜的柔性显微镜。该广本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种广视场显微镜，包括：配置成固定其内有荧光材料的样品的平台；配置成产生基本平行的激发光束的多光子激发光源，该激发光束具有的单光子能量低于所述荧光材料的单光子激发所需的吸收能量；无限校正物镜，其光学耦合到该多光子激发 光源并被配置成将基本平行的激发光束聚焦到样品上，以使荧光材料的多光子激发在样品的预定区域上同时发生；配置成将从该样品的所述预定区域发出的发射光同时地聚焦到图像探测器的至少两个像素上的聚焦透镜。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：加里布鲁克，
申请(专利权)人：加里布鲁克，
类型：发明
国别省市：US[美国]