用于荧光共焦显微镜检查的方法和设备技术

本发明专利技术提出了一种新的改进的共焦荧光显微镜。相对于现有的显微镜共焦成像器的实际应用，新的显微镜具有明显的优势。和以前的共焦成像器一样，相对于常规宽视场和共焦荧光成像器，本发明专利技术具有若干优势。然而，本发明专利技术还在成本和复杂性方面解决了共焦技术的缺点，并且由于部件的简单化以及消除了对比如针孔或狭缝的空间滤光片的需求而在这两方面提供了明显的节省。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及光学显微镜检查领域，具体涉及共焦荧光显微镜检查领域以及通过共焦荧光显微镜检查获得荧光标记的目标的图像的方法。
技术介绍
通常，根据如何俘获或处理荧光图像信息，可将大多数荧光显微镜归类为下列普通类别的其中之一宽视场显微镜在这些显微镜中，利用如在任何标准显微镜中的常规宽视场策略并且收集荧光发射使目标成像。通常，荧光污染或标记的样本利用适当波长的激发光来照亮，并且发射光用来获得图像；光学滤光片和/或分色镜用来分离激发光和发射光。结构光显微镜这是对沿显微镜的光轴提供增强的空间分辨率的显微镜的修改。该特征考虑了成像标本的光学切片。结构光照明装置的主要部件是一维光栅。光栅图案被系统地投射到标本上并且被移进越过样本的物镜的焦平面；发射光被收集并被编辑以此产生图像。在对光栅上不同位置俘获的标本的三幅图像进行处理之后，生成一幅这样的“结构光”图像。通常，投射的光栅图像为物镜焦平面上的物提供了较强的强度的空间调制，同时焦平面上方和下方面积上的强度调制被明显减少。当发射辐射被收集时，图像处理算法消除来自如由光栅定义的原像平面上方或下方的较弱信号。由此生成的图像因此无任何杂散光或离焦数据。另外，因为结构光照明装置利用基质宽视场显微镜的照明光源，该显微镜的所有荧光能力被保持。真实共焦显微镜共焦显微镜使用专用的光学系统来成像。在最简单的系统中，在相关荧光团的激发波长下工作的激光器被聚焦至样本上的一点；同时，来自这个照明点的荧光发射在小面积检测器上成像。自样本的所有其他面积发射的任何光被位于检测器前方的较小的针孔抑制，所述检测器传输源自照明斑点的光。激发斑点和检测器以光栅图扫过样本以此形成完整的图像。存在有各种不同策略用来改进和优化本领域技术人员公知的速度和透光率。行-共焦显微镜这是对共焦显微镜的修改，其中荧光激发源是激光束；然而，射束在样本上聚焦成一窄行而不是单个点。荧光发射接着通过充当空间滤光片的狭缝在光学检测器上成像。自样本的任何其他面积发射的光保持离焦并且结果被狭缝所阻挡。为了形成二维图像，所述行扫过样本同时读取行照相机。该系统可以通过利用适当的光学布置被扩展成可同时使用若干激光器和若干照相机。然而，这样的行共焦显微镜通常是复杂且昂贵的，并且因此对于许多应用来说是不切合实际的。存在有对组合了共焦和行共焦显微镜的优点与其他系统的简单化及经济实惠的显微镜的实际需求。
技术实现思路
本专利技术提出了一种新的改进的共焦荧光显微镜。相对于现有的显微镜共焦成像器的实际应用，新的显微镜具有明显的优势。和以前的共焦成像器一样，相对于常规宽视场和共焦荧光成像器，本专利技术具有若干优势。然而，本专利技术还在成本和复杂性方面解决了共焦技术的缺点，并且由于部件的简化以及消除了对比如物理空间滤光片(如针孔或狭缝)的需求而在这两方面提供了明显的节省。该系统还可与包括薄底96,386和1536-孔板、显微镜载玻片的许多微孔板相兼容，并且可支持各种荧光染料。该系统包含至少一个或多个(优选地为两个或多个)光源(优选地为激光器)，所述光源将在与相应的荧光或荧光污染或标记的目标对准的不同激发波长下工作。利用带通光学滤光片过滤来自每个目标的荧光发射，并且通过至少一个成像装置(优选地为两个或多个成像装置)收集发射数据。与上述现有的宽视场荧光显微镜相比该系统提供了某些截然不同的优点，包括改进的图像质量和增加的敏感度。更具体地说，在普通的荧光显微镜中，自焦平面上方和下方的材料的荧光发射导致不想要的背景荧光。常规宽视场荧光显微镜未提供对这种背景的有效抑制，并且因此，这样的显微镜将由加在较大背景信号上并被这个背景信号影响的目标多孔材料产生相对较小的信号。例如，当带有生物样本的微量滴定板通过宽视场荧光显微镜成像时，来自孔板的清洁的塑料底部的背景和多孔材料上方的介质将通常基本上大于多孔材料的信号。这种图像的分析按照常规通过估计并且接着减去这种背景来实现。然而，这种估计引入了下列问题1、所关注信号中的统计噪声作为背景的结果被增加。这降低了识别所关注特征的能力，因为这种背景荧光通常是形成图像中＞90％的噪声的原因并且必须通过估计背景噪声的影响进行校正。另外，因为这种估计涉及某些假定，这使得分析和解释变得复杂并且它降低了系统的敏感度。2、估计和去掉背景在计算上是昂贵的并且花费了大量的时间。通常，在这样的系统中～50％的分析时间专用于估计背景。对于其中背景具有不规则和高对比结构的情形(如其中高荧光颗粒漂浮在介质中的化验)，图像的显著部分实际上可能是难以分析的，因为不能构建背景的精确模式。共焦成像显微镜的使用将通常相对于来自焦平面的荧光信号将这种背景荧光抑制到原来的1/20或/1/100，从而允许获得更精确的图像。然而，共焦显微镜常常是昂贵的并且其操作和使用是复杂的。本专利技术系统通过引入简化的检测子系统降低了系统的成本和复杂性，所述简化的检测子系统包含能够随机访问用于检测荧光发射的一个或多个检测器。检测器优选地为低成本的CMOS光学传感器，所述CMOS光学传感器由于可以忽略的暗电流而使影响最小，即使当传感器是在室温下工作的，然而还可以使用其他基于像素的检测器(如适当的CCD照相机)。适当的检测装置在Orly Yadid-Pecht和Ralph Etienne-Cummings(编辑者)、Springer(出版者)的第一版(2004年5月31日)的CMOS ImagersFrom Phototransduction to ImageProcessing进行了描述，其内容通过引用而被结合在此。在优选实施例中，检测器还结合卷帘式快门单元来限制用于光检测的检测器的瞬时面积。这个面积的尺寸(如行共焦成像情形下的卷帘式快门的宽度)将通常小于或等于光共轭至检测器的照明面积。另外，系统使用至少一个以及优选地为两个或多个光源来提供激发光。事实上，可以使用具有或不具有滤光片的、能够发射光的任何光源(如灯)。这种光源对本领域的技术人员来说将是易于理解的。优选的光源包括用于这种照明的更明亮的窄带光源，更优选地为激光器。在优选实施例中，激发光以行的形式而不是单个点的形式在目标上聚焦，并且所述行扫过目标的表面。如前面所讨论的，行共焦成像器在本领域中是已知的，并且优选的系统在没有复杂性和高成本的情形下赋予了常规行系统的好处。成像目标上的行形状的照明面积可以通过本领域技术人员已知的任何单元来产生，但是优选地通过鲍威尔透镜来产生。在另外的优选实施例中，行形成单元与CMOS检测器配对，所述CMOS检测器在卷帘式快门模式下工作以此产生低成本、简单并易于使用的行共焦扫描仪。检测器还可结合窄带的激光线专用的滤光片，其可用来抑制激发光。这些类型的滤光片可以与具有被调节至荧光团的发射光谱的光学带宽的其他滤光片一起组合使用。一种优选的组合是使用与Schott Veril线性可变滤光片串联的Rugate陷波滤光片。通过适当控制线性滤光片在光学检测器前面的位置，能够利用相同的激发激光器使若干荧光团成像。同样地，灵活性允许可在多种模式下工作的混合显微镜的构造。在这种混合装置的优选实施例中，在一种工作模式下，混合显微镜是以本专利技术的方式工作的行共焦显微镜；在第二种工作模式下，当照明系统被调节成可照亮显微镜的整个视场时，混合显微镜按照本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于荧光目标的共焦荧光显微镜检查扫描的设备，包含：提供激发辐射的至少一个光源和检测来自所述荧光目标的荧光发射的至少一个检测器，改进包含使所述一个或多个检测单元能够随机访问读取所述荧光发射。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：P东德斯，C扎拉特，PA福米乔夫，
申请(专利权)人：通用电气医疗集团尼亚加拉有限公司，
类型：发明
国别省市：CA[加拿大]