本发明专利技术是一种利用荧光探针在极端pH值下的活性细胞成像方法，属分析化学领域。以喹哪啶衍生物(E)-2-(2,4-二羟基苯基)乙烯基-8-羟基喹啉，简称探针，为活性细胞中检测pH的荧光成像探针。先用乙腈和缓冲溶液分别配制pH为2~4、10~12的探针溶液，再将探针与活性细胞孵化后，用荧光倒置显微镜检测，分别呈现绿色荧光、红色荧光的细胞图像，随pH值的变化，细胞的荧光颜色和强度都发生变化；而探针在pH为5~9范围，则观察不到细胞的荧光图像。探针的化学结构式为。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属分析化学领域，具体地说是一种利用荧光探针检测活性细胞中pH的方 法。
技术介绍
荧光探针与荧光显微技术的结合，使荧光探针在生物活性物质检测和细胞成像方 面得到广泛应用。对生物活性物质而言，检出的灵敏度极限是单个分子而对测试技术有更 高的灵敏度要求，同时也有更苛刻的测试条件要求。荧光成像分析是目前广泛应用于活细 胞分析的一种高灵敏的可视化分析技术。活细胞成像技术是生命科学
中重要的研 究手段，与固定细胞研究结合起来，可以解释活细胞中的多种生命现象。细胞生物学中量度 细胞内的pH值、细胞的增殖和凋亡、细胞内吞作用、离子运输和动态平衡、多药抗药性，生物 分析化学和医学健康血液中pH值等均与pH密切相关。目前用于活细胞成像分析的荧光探针 多为有机荧光染料分子。在实际应用中，这些分子存在荧光寿命较短、容易猝灭及稳定性差 的缺点。特别是大多数的质子化荧光探针的荧光随pH值的增大呈单一减弱变化，表现为酸 性为"On"碱性为"Off"，极少数随pH值的增大呈单一增强变化，表现为酸性"Off"碱性"On"， 很少有在能在强酸、强碱极端介质条件下实现细胞成像。已报道的有些类荧光探针荧光强 度随pH变化会不同程度地受到共存于体系中的生物相关金属离子、阴离子及氨基酸、糖类 等生物小分子的干扰。在极端pH下实现长时间的实时动态连续测定，提高细胞的可视化分 析的选择性和精度是迫切需要解决的问题。具有良好的光稳定性、合适的水溶性及细胞膜 通透性且对细胞无毒，而且能在不同酸、碱介质中能在细胞内发射不同波长强荧光的探针 极为罕见。
技术实现思路
本专利技术的目的在于研究一种在极端pH值下对活性细胞成像的荧光探针新方法。是 一种对pH高灵敏、高选择性检测识别的荧光探针，并能实现对活体细胞中氢离子的荧光染 色和成像。 本专利技术一种利用荧光探针在极端pH值下的活性细胞荧光成像方法是以喹哪啶衍 生物(E )-2-( 2，4-二羟基苯基）乙烯基-8-羟基喹啉，简称探针，作为极端pH值下的活性细胞 荧光成像探针，其结构式为：方法是：（1)用探针乙腈溶液和缓冲溶液配制pH在2~4范围的探针溶液，再将探针与活 性细胞孵化后，用荧光显微镜检测，呈现清晰的绿色荧光细胞图像，随pH值的增大，细胞的 绿色荧光减弱；（2)用探针乙腈溶液和缓冲溶液配制pH在10~12范围的探针溶液，再将探针 溶液与活性细胞孵化后，用荧光显微镜检测，呈现清晰的红色荧光细胞图像，随pH值的增 大，细胞的红色荧光增强；（3)用探针乙腈溶液和缓冲溶液配制pH在5~9范围的探针溶液，再 将探针与活性细胞孵化后，荧光显微镜检测不到细胞的荧光图像;上述所指极端pH值是指 pH2~4、pH10~12。 所述的一种利用荧光探针在极端pH值下的活性细胞荧光成像方法是用乙腈和缓 冲溶液配制探针溶液的方法为：（1)用乙腈溶解探针试剂，配成探针浓度1〇〇μΜ的乙腈溶液； 用浓度为50mM的三羟甲基氨基甲烷Tris和50mM的HC1溶液，用pH计调节，配成ρΗ=2~9的不同 pH值的缓冲溶液;取浓度为100μΜ的探针乙腈溶液100yL，加 Tris-HCl缓冲溶液900yL，配制 成pH=2~9的不同pH值的探针溶液；（2)用乙腈溶解探针试剂，配成探针浓度100μΜ的乙腈溶 液；用浓度为50mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES和50mM的NaOH溶液，用pH计调节，配成ρΗ=10 ~12的不同pH值的缓冲溶液;取浓度为100μΜ的探针乙腈溶液100yL，加 HEPES-NaOH缓冲溶液 900yL，配制成pH=l 0~12的不同pH值的探针溶液。 所述的一种利用荧光探针在极端pH值下的活性细胞荧光成像方法是探针与活性 细胞孵化的方法，是用人体前列腺癌细胞PC3,经复苏接种于含10%胎牛血清以及含1%双抗 的培养基中，培养基改良型RPMI-1640,在温度为37°C，5%C0 2以及饱和湿度为100%的培养箱 中培养，每隔2-3天传代1次，选择生长状态良好的细胞接种于12孔板中培养，密度为2 X104 个/ml，次日用新鲜培养基清洗细胞两次，将细胞分别浸入含不同pH值的探针培养液中，在 培养箱中孵育，使不同pH值的缓冲溶液配制的探针对细胞染色，吸出含探针的培养液，用新 鲜培养基清洗细胞，然后用荧光显微镜检测。 所述的一种利用荧光探针在极端pH值下的活性细胞荧光成像方法是探针与细胞 的孵化过程中，控制探针的浓度在10~1〇〇μΜ范围，探针能很好渗透到活体PC3细胞内，细胞 呈圆润饱满状，探针与细胞具有良好的相容性，探针与细胞的孵化时间在20~30min内未见 细胞凋亡，探针对细胞无毒性;荧光显微镜检测时，在pH为2~4的范围，用荧光显微镜的绿色 通道，激发波长为450~490 nm检测，呈现清晰的绿色荧光细胞图像;在pH为10~12的范围，用 荧光显微镜的红色通道，激发波长为510~550nm检测，呈现清晰的红色荧光细胞图像;在pH 为5~9的范围，用荧光显微镜的红色或绿色通道检测，不显现细胞图像。 所述的一种利用荧光探针在极端pH值下的活性细胞荧光成像方法是所用的试剂 为分析纯或生化试剂，所用水为二次蒸馏水或生理盐水;所用活性PC3细胞为人体前列腺癌 细胞;所用的拍照设备为荧光倒置显微镜。 所述的一种利用荧光探针在极端pH值下的活性细胞荧光成像方法是利用所述探 针的荧光成像方法对活性细胞内pH检测:活性PC3细胞经复苏、接种、传代、培养、清洗后，将 细胞分别浸入pH为3 · 6或pH为10 · 6的50mM缓冲溶液中，在37°C，5%C02以及饱和湿度为100% 的培养箱中孵育5~10min，吸出含不同pH值的缓冲溶液，用新鲜培养基清洗细胞3次;用荧光 显微镜检测;再将上述细胞浸入含10mM探针的培养液中孵化lh，吸出含探针的培养液，用新 鲜培养基清洗细胞3次，用荧光显微镜检测;经pH为3.6的缓冲溶液孵化的细胞，观察不到细 胞的荧光图像，该细胞再经探针孵化后，清晰地观察到绿色荧光细胞图像;经pH为10.6的缓 冲溶液孵化的细胞，观察不到细胞的荧光图像，该细胞再经探针孵化后，清晰地观察到红色 荧光细胞图像。 本专利技术的新颖性主要体现 在（1)本专利技术在pH为2~4及10~12的极端pH值范围进行活性癌细胞的荧光成像，有别于大多 数探针的活细胞荧光成像只能在中性条件下进行，在强酸、强碱性下探针不发荧光，且细胞 很难存活；（2)本专利技术在酸性和碱性条件下，探针对细胞的成像发射的荧光波长不同，可以 分别在绿色通道和红色通道获得绿色、红色荧光的清晰细胞图像，可视性强、稳定性好；（3) 本专利技术细胞成像时的荧光波长及强度均与pH有灵敏的响应性，可用于活细胞的定性、定量 检测；（3)本专利技术所用探针对细胞有良好的膜穿透性，并且对细胞无毒。【附图说明】 图1探针在不同pH值下对活性PC3细胞的荧光显微镜拍摄照片。 A:在pH=2.0的Tris-HCl缓冲溶液中，探针（10 μΜ)对PC3细胞染色后的暗场荧光显 微照片，用荧光显微镜的绿色通道(激发波长为450~490nm)检测，观测到亮绿色荧光的细胞 分布图，证明探针在该pH值实现了细胞内染色，呈现细胞染色荧光成像。 B:在pH=4.0的Tr本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用荧光探针在极端pH值下的活性细胞荧光成像方法，其特征是以喹哪啶衍生物(E)‑2‑(2,4‑二羟基苯基)乙烯基‑8‑羟基喹啉，简称探针，作为极端pH值下的活性细胞荧光成像探针，其结构式为：方法是：（1）用探针乙腈溶液和缓冲溶液配制pH在2~4范围的探针溶液，再将探针与活性细胞孵化后，用荧光显微镜检测，呈现清晰的绿色荧光细胞图像，随pH值的增大，细胞的绿色荧光减弱；（2）用探针乙腈溶液和缓冲溶液配制pH在10~12范围的探针溶液，再将探针溶液与活性细胞孵化后，用荧光显微镜检测，呈现清晰的红色荧光细胞图像，随pH值的增大，细胞的红色荧光增强；（3）用探针乙腈溶液和缓冲溶液配制pH在5~9范围的探针溶液，再将探针与活性细胞孵化后，荧光显微镜检测不到细胞的荧光图像；上述所指极端pH值是指pH2~4、pH10~12。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：曾晞，朱勤，牟兰，吴玉田，曾莉，张红，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：贵州;52
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