一种哺乳动物启动子活性评价质粒载体及应用制造技术

一种哺乳动物启动子活性评价质粒载体及应用属于基因工程领域，具体涉及一种基于目的蛋白连接Cre重组酶与Lox2272‑Loxp序列特异识别实现评价目的蛋白与基因启动子相互作用的方案。通过Cre重组酶与Lox2272‑Loxp序列的特异性识别，实现启动子先反转，后启动，从而实现下游的萤火虫荧光素酶延迟转录。该方案的优势可极大降低荧光素酶背景，使荧光素酶滞后于目的蛋白表达，更灵敏反应目的蛋白对靶基因启动子的调控作用。本发明专利技术提供了一套瞬时转染质粒载体，其能够实现蛋白与启动子互相作用高灵敏分析。载体A其核苷酸序列如Seq ID No.1所示；载体B其：核苷酸序列如Seq ID No.2所示。

【技术实现步骤摘要】
一种哺乳动物启动子活性评价质粒载体及应用
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种基于目的蛋白连接Cre重组酶与Lox2272-Loxp序列特异识别实现评价目的蛋白与基因启动子相互作用的方案。特别涉及一种通过Cre重组酶与Lox2272-Loxp序列的特异性识别，实现启动子序列的反转，从而实现启动子下游的萤火虫荧光素酶得以表达。该方案的优势可极大降低荧光素酶背景，使荧光素酶的表达滞后于目的蛋白表达，更灵敏反应目的蛋白对靶基因启动子的调控作用。
技术介绍
1.DNA与蛋白相互作用的研究在许多的细胞生命活动中，例如DNA复制、mRNA转录与修饰以及病毒的感染等都涉及到DNA与蛋白质之间的相互作用的问题。随着DNA重组技术的发展，人们已经分离得到了很多重要基因，且对基因的调控研究越发趋于透彻。在DNA与蛋白相互作用的研究中，科研工作者取得了越来越多丰硕的成果，但是细胞内的调控属于类似网状结构，错综复杂，给科研工作带来了很多挑战。然而，了解DNA与蛋白互作对生命科学和临床医学研究至关重要，目前研究表明，DNA与蛋白的互作可以调控基因的转录，翻译，表观遗传修饰等重要的生理过程。目前研究DNA-蛋白质相互作用的经典实验方法主要包括：1、凝胶阻滞法；2、DNaseI足迹法；3、甲基化干扰法；4、体内足迹法与下拉实验法。凝胶阻滞法，又称为DNA迁移率变动实验，或条带阻滞实验，产生于80年代初期，其原理主要是在凝胶电泳中，由于电场的作用，DNA分子在电场中由负极向正极泳动的速度与距离与DNA分子量成反比。若DNA分子与某个蛋白结合，则会改变DNA的整体分子质量，从而使其在凝胶电泳中受到阻滞，使得泳动距离缩短，呈现片状弥散的放射状条带，从而可判定DNA与某个蛋白存在相互作用。该方法操作简便，可以用于鉴定在特殊类型细胞蛋白质提取物中，是否存在能同某一特定的DNA(含有转录因子结合位点)结合的转录因子蛋白质。但该方法阴性率较高，某些DNA与蛋白的互作须在辅助作用因子的参与下进行，或在体内的互作具有严格的时空效应。因此，采用该方式进行时，只能判断直接与DNA分子有较强亲和力的直接作用蛋白，对于复杂的多因素互相作用，该方式无法进一步判别。在上一步方案的基础上，科学家又发展了DNaseI足迹实验，一种用来检测被特定转录因子蛋白质特异性结合的DNA序列的位置及其核苷酸序列结构的专门实验方法。当DNA分子中的某一区段同特异的转录因子结合之后便可以得到保护而免受DNaseI酶的切割作用，而不会产生出相应的切割分子，结果在凝胶电泳放射性自显影图片上便出现了一个空白区，俗称为"足迹"。如果蛋白质提取物中不存在与DNA结合的特定蛋白质，使DNaseI消化之后，便会产生出距离放射性标记末端1个核苷酸，2个核苷酸，3个核苷酸--等等一系列前后长度均相差一个核苷酸的不间断的DNA片段集合。如果DNA分子同蛋白质提取物中的某种转录因子结合，被结合部位的DNA就可以得到保护免受DNaseI酶的降解作用。实验组凝胶电泳显示的序列，出现空白的区域表明是转录因子蛋白质结合部；与对照组序列比较，便可以得出蛋白质结合部位的DNA区段相应的核苷酸序列。该实验方法具有较高的灵敏度，但是需要精细的操作和反复的摸索尝试，从多次的结果中按照概率进行统计分析，同时，该实验较多的应用同位素标记，对实验人员的安全也有一定的挑战。在目前的蛋白与DNA互作的研究中，应用较多的是下拉实验法，拉下实验又叫做蛋白质体外结合实验(bindingassayinvitro)，是一种在试管中检测蛋白质之间相互作用的方法。其基本原理是将某种小肽(例如生物素、6-His标签以及谷胱甘肽转移酶等)的编码基因与诱饵蛋白的编码基因重组，表达为融合蛋白。分离纯化目的蛋白并与磁珠或琼脂糖凝胶珠结合，固定化后，将结合有目的蛋白的磁珠或琼脂糖珠投放至靶细胞DNA片段化裂解液中，摇动孵育一定时间后，采用高通量测序方式，对结合的DNA片段进行鉴定。该方式可较为精确的判定与靶蛋白相互做用的DNA信息，但是成本较为巨大，由于体内DNA与蛋白的相互作用存在时空性，而采用下拉实验只能考察某一短暂时刻下靶蛋白与DNA的相互作用信息。2.蛋白调控基因转录研究在蛋白调控基因转录的研究领域中，最常用到的是启动子的活性分析，一个基因在体内的含量大小，与该基因的启动子活性密不可分，当启动子活性升高时，位于下游的目的基因可以在细胞内累计，反之则蛋白含量减少。若要衡量某个蛋白对某个基因转录是否具有调控作用，通常我们选择衡量该蛋白对靶基因的启动子的调控作用。在该调控作用的研究中，最广谱的方式为双荧光素酶分析测定法。双荧光素酶是包含了两种荧光素酶，分别为萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶，二者在对应的底物存在条件下，能高灵敏的产生化学发光，采用相应的仪器可对该发光值进行测定。通常情况下，将萤火虫荧光素酶挂载于目的基因启动子下，而海肾荧光素酶为转染效率参比对照。在进行目的蛋白对某基因启动子活性分析时，首先要构建目的蛋白的瞬时表达载体，同时将靶基因的启动子构建至双荧光素酶分析载体上。采用瞬时转染方式将两个载体转入293T细胞，并于转染完成后48小时进行细胞裂解液双荧光素酶分析测定。从而得到靶蛋白对某基因启动子启动效率的影响。但是传统的方式存在较大的弊端，首先，当两个载体瞬时转染进入293T细胞后，无法控制表达的先后次序，在靶蛋白还未表达时，荧光素酶可能已经开始表达，这部分荧光素酶，会形成较高的化学发光背景，从而使蛋白对基因启动子活性的影响得到弱化，对分析结果带来不利的影响，形成较高的假阳性和不稳定性。基于上述情况，本专利技术设计了一套启动子活性评价载体，采用Cre重组酶与靶蛋白连接共表达，同时将靶基因启动子序列逆向插入Lox2272与Loxp组合序列内，该方式使得启动子序列在体内首先经过反转，进行反转的前提是融合有靶蛋白的Cre蛋白表达。启动子序列反转完成后，再进行荧光素酶的转录启动过程，从而使荧光素酶的表达始终滞后于靶蛋白的表达，极大的降低了荧光素酶的本低表达对结果的分析带来的影响，提高了阳性率和活性分析灵敏度
技术实现思路
本专利技术提供了一套瞬时转染质粒载体，其能够实现指定启动子细胞内转录活性的高灵敏分析。具体而言，本专利技术提供了一套重组质粒，载体A其特征在于：核苷酸序列如SeqIDNo.1所示；载体B其特征在于：核苷酸序列如SeqIDNo.2所示。另一方面，本专利技术提供一种骨干质粒载体，其特征在于，载体A特征在于，在真核启动子下游，具有载体限制性内切酶线性化位点EcoRI，在EcoRI酶切位点下游，连接有IRES2核糖体进入元件，在IRES2核糖体进入元件下游，连接有ZsGreen绿色荧光蛋白编码序列。Cre重组酶编码序列与ZsGreen绿色荧光蛋白编码序列采用T2A连接肽编码序列相连接，且中间带有GSG柔性连接肽段编码序列。进一步，载体A的真核启动子为CMV启动子，其包含CMV增强子，CMV核心启动子。其中CMV增强子位置与序列如SeqIDNo.1第235至614位所示；CMV核心启动子位置与本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.质粒载体，其特征在于，包括载体A和载体B；其中载体A具体为：在真核启动子下游，具有载体限制性内切酶线性化位点EcoRI，在EcoRI酶切位点下游，连接有IRES2核糖体进入元件，在IRES2核糖体进入元件下游，连接有ZsGreen绿色荧光蛋白编码序列；Cre重组酶编码序列与ZsGreen绿色荧光蛋白编码序列采用T2A连接肽编码序列相连接，且中间带有GSG柔性连接肽段编码序列；/n载体B具体为：在真核广谱启动子下游连接有海肾荧光素酶蛋白(hRluc)和杀稻瘟菌素抗性蛋白(BSD)表达框，hRluc与BSD编码序列通过P2A连接肽编码序列相连接；在启动子插入位点的上游，载体B包含cer region元件，PolyA序列及pause site转录终止序列；在pause site转录终止序列下游，包含Loxp与Lox2273组合元件，该组合元件包含一对反向LoxP序列和一对反向Loxp2272序列，同时，在Loxp与Lox2272组合元件中间，设计有一对BbsI酶切位点，该位点为启动子插入位点；在组合元件下游包含荧光虫荧光素酶编码序列。/n

【技术特征摘要】
1.质粒载体，其特征在于，包括载体A和载体B；其中载体A具体为：在真核启动子下游，具有载体限制性内切酶线性化位点EcoRI，在EcoRI酶切位点下游，连接有IRES2核糖体进入元件，在IRES2核糖体进入元件下游，连接有ZsGreen绿色荧光蛋白编码序列；Cre重组酶编码序列与ZsGreen绿色荧光蛋白编码序列采用T2A连接肽编码序列相连接，且中间带有GSG柔性连接肽段编码序列；
载体B具体为：在真核广谱启动子下游连接有海肾荧光素酶蛋白(hRluc)和杀稻瘟菌素抗性蛋白(BSD)表达框，hRluc与BSD编码序列通过P2A连接肽编码序列相连接；在启动子插入位点的上游，载体B包含cerregion元件，PolyA序列及pausesite转录终止序列；在pausesite转录终止序列下游，包含Loxp与Lox2273组合元件，该组合元件包含一对反向LoxP序列和一对反向Loxp2272序列，同时，在Loxp与Lox2272组合元件中间，设计有一对BbsI酶切位点，该位点为启动子插入位点；在组合元件下游包含荧光虫荧光素酶编码序列。


2.如权利要求1所述质粒载体，其特征在于，载体A核苷酸序列如SeqIDNo.1所示，载体B核苷酸序列如SeqIDNo.2所示。


3.如权利要求1所述质粒载体，其特征在于，载体A的真核启动子为CMV启动子，CMV启动子包含CMV增强子，CMV核心启动子；其中CMV增强子位置与序列如SeqIDNo.1第235至614位所示；CMV核心启动子位置与序列如SeqIDNo.1第615至818位所示。
载体A包括IRES2元件、ZsGreen绿色荧光蛋白编码序列、T2A连接肽编码序列、GSG柔性肽编码序列及Cre重组酶编码序列；其中IRES2元件序列如SeqIDNo.1第901至1487位所示；ZsGreen绿色荧光蛋白编码序列如SeqIDNo.1第1488至2180位所示，GSG柔性肽核苷酸序列如SeqIDNo1第2181至2198位所示；T2A连接肽位置及序列如SeqIDNo.1第2199至2252位所示；Cre重组酶编码序列如SeqIDNo1第2259至3290位所示；
载体A包含嘌呤霉素筛选标记，其启动子为SV40启动子，位置与序列如SeqIDNo.1第4028到4357位所示；嘌呤霉素编码序列与序列信息如SeqIDNo.1第4424到5023所示；
载体B核苷酸序列如SeqIDNo.2所示，载体B的hRlu-P2A-BSD表达框真核启动子为SV40启动子，SV40启动子位置与序列如SeqIDNo.2第1至358位所示；其中，hRluc位置与序列如SeqIDNo.2第409到1341位所示；P2A连接肽位置与序列如SeqIDNo.2第1390到1446位所示；BSD抗性蛋白编码序列位置与序列如SeqIDNo.2第1453到1851位所示；
载体B包含CerRegion元件与转录终止组合元件，CerRegion元件位置与序列如SeqIDNo.2第3956到4239位所示；转录终止组合元件包含PolyA序列与pausesite转录终止元件，其中Pol...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘馨慧，黄华，李欢，
申请(专利权)人：北京工业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11