一种人多能干细胞中可诱导高效表达基因体系的建立及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种构建人多能干细胞中可诱导高效表达的基因体系，具体是基于PiggyBac转座子系统，在体外快速通过无缝克隆的方式构建含外源基因的PiggyBac转座子质粒，并通过与含转座酶基因的PB200PA质粒共转染人多能干细胞，建立起可以通过DOX诱导高效表达外源基因的人多能干细胞模型，该方法简单快捷，构建所得的基因体系稳定，且可在人多能干细胞中高效表达特定外源基因，并能实现在特定时间诱导外源基因过表达，可以广泛应用于多能干细胞的相关基因研究中。

【技术实现步骤摘要】
一种人多能干细胞中可诱导高效表达基因体系的建立及应用
本专利技术涉及表达基因体系的建立技术，具体是涉及一种人多能干细胞中可诱导高效表达基因体系的建立及应用。
技术介绍
人多能干细胞具有强大的自我更新、自我复制能力，并且可以分化成体内所有的细胞，形成人体内所有组织和器官。在体外进行人多能干细胞的培养为器官再生、修复和疾病治疗方面的研究提供了强大的推动力。在对增殖、分化、迁移调控相关影响因素的基础研究，细胞移植及基因载体治疗的临床研究及移植治疗疾病过程中的机制研究等方面具有巨大的应用前景。近些年来，由于种属差异，动物模型与人类在生理、病理情况下存在很大差异，很多研究结果不能应用于人类。尤其是在基础研究领域，损伤修复及移植治疗疾病过程研究中，对于细胞外基质相关蛋白、细胞生长因子、信号传导通路等对细胞多能性、增殖、分化、迁移及移植治疗中影响多向分化潜能的细胞因子及相关基因的机制仍不清楚。因此，如何在体外建立高效表达外源性基因的人多能干细胞的方法对于研究以上问题具有重要作用。目前对于过表达基因的人多能干细胞的建立主要采用慢病毒载体系统使外源性基因整合到宿主基因组中，但由于人多能干细胞自身的特性使得对于病毒载体启动子的要求极为苛刻及对病毒浓度、纯度的高要求和通过电转体系建立过表达的人多能干细胞系由于其对电转体系的高要求及电穿孔造成的细胞较高死亡率使得外源性基因表达受到限制，因此探索新的方法快速、高效地实现外源性基因的表达具有重要的意义。PiggyBac转座子系统具有转座效率高、删除精确、半随机插入和携带片段较大等优点。但是作为一种转基因实验的工具，特别是在哺乳动物个体水平的转基因方面，还存在转基因效率待提高、外源基因随机插入对内源基因破坏的风险待降低等问题待解决。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有多能干细胞中过表达外源基因效率低等技术的不足，提供一种构建人多能干细胞中可诱导高效表达的基因体系，该方法简单快捷，构建所得的基因体系具有以下优点：体系稳定；可在人多能干细胞中高效表达特定外源基因；可在特定时间诱导外源基因过表达等。基于该体系的构建方法可以阐明该基因在干细胞中相关功能及调节机制。本专利技术的具体方案如下：一种人多能干细胞中可诱导高效表达基因体系的建立，包括以下步骤：步骤一：使用无缝克隆的方式构建TRE6P-P2A-EGFP质粒；步骤二：构建含过表达外源基因的PiggyBac转座子质粒；步骤三：使用所述含过表达外源基因的PiggyBac转座子质粒和含转座基因酶的PB200PA质粒共转染人多能干细胞；步骤四：建立表达所述外源基因的稳定细胞株。进一步的，使用强力霉素(记作DOX)诱导所述外源基因的表达。优选的，所述强力霉素的浓度为1～2ug/ml，诱导时间为20～30小时。优选的，所述TRE6P-P2A-EGFP质粒的构建具体包括以下步骤：步骤一：设计P2A-EGFP特异性无缝克隆引物：包括P2A-EGFP正向引物(如SEQID:1所示)和P2A-EGFP反向引物(如SEQID:2所示)，进行PCR扩增，得到P2A-EGFP片段；步骤二：对PB-TRE6P质粒进行酶切、跑胶、纯化；步骤三：将所述P2A-EGFP片段插入所述经步骤二处理过的PB-TRE6P质粒中，再经筛选获得所述TRE6P-P2A-EGFP质粒。优选的，所述P2A-EGFP片段的插入位置为所述经步骤二处理过的PB-TRE6P质粒的TRE3G启动子和3Xflag序列中间。优选的，所述转染过程包括以下步骤：步骤一：将所述人多能干细胞培养到密度为3.5～4.5x105个细胞/35mm培养皿，更换干细胞培养液；步骤二：将所述人多能干细胞滴入含有所述含过表达外源基因的PiggyBac转座子质粒与所述PB200PA质粒的脂质体转染培养液中；步骤三：每天更换所述脂质体转染培养液，得到转染了含过表达外源基因的PiggyBac转座子质粒的人多能干细胞。优选的，所述含过表达外源基因的PiggyBac转座子质粒与所述PB200PA质粒的质量比为(4～7):1。优选的，所述含过表达外源基因的PiggyBac转座子质粒与所述PB200PA质粒的脂质体转染培养液的具体制备方法为：将所述含过表达外源基因的PiggyBac转座子质粒与所述PB200PA质粒加入到培养液中，随后将所述培养液稀释80～120倍，再转移到含有脂质体转染试剂的培养液中混匀、静置。进一步的，将所述转染了含过表达外源基因的PiggyBac转座子质粒的人多能干细胞培养到密度为8.5～9.5x105个细胞/35mm培养皿，使用嘌呤霉素处理细胞，经传代筛选获得所述稳定细胞株。优选的，所述嘌呤霉素的浓度为0.5～1ug/ml，并传代筛选2～4代。其中：所述PB-TRE6P质粒的描述详见附图1；所述P2A-EGFP特异性无缝克隆引物是根据P2A-EGFP基因的CDS序列和所述质粒PB-TRE6P的MCS位点设计而来，其中，P2A-EGFP正向引物含酶切位点：HindIII、BamHI、EcoRI；P2A-EGFP反向引物含有酶切位点SalI。PB200PA质粒的图谱详见附图4。本专利技术的有益效果为：本专利技术基于PiggyBac转座子系统，在体外快速通过无缝克隆的方式构建含外源基因的PiggyBac转座子质粒，并通过与含转座酶基因的PB200PA质粒共转染人多能干细胞，建立起可以通过DOX诱导高效表达外源基因的人多能干细胞模型，可以广泛应用于多能干细胞的相关基因研究中。目前对于过表达基因的人多能干细胞的建立主要采用慢病毒载体系统使外源性基因整合到宿主基因组中，但由于人多能干细胞自身的一些特性，使得对于病毒载体启动子的要求极为苛刻，对病毒浓度和纯度的要求也很高。比如，人多能干细胞本身具有强大的复制能力和多潜能性，前者赋予了细胞强大的增殖能力，这使得研究者不得不面临这样的挑战：如何保证细胞在培养过程中的稳定性；后者的多潜能性，可以允许细胞向不同方向分化，从而得到多种终末细胞产品，但同时也会在应用过程中导致畸胎瘤或其他的危险。此外，通过电转体系建立过表达的人多能干细胞系对电转体系的高要求及电穿孔造成细胞的较高死亡率也使得外源性基因表达受到限制。而采用本专利技术的方法的进步之处主要有：通过本专利技术的方法建立的过表达的人多能干细胞系弥补了上述两种方法的不足，只需通过普通的转染试剂进行转染质粒就可以得到稳定的基因表达体系。本专利技术使用两种表达载体：PiggyBac转座子和含转座基因酶的PB200PA表达载体，共转染人多能干细胞。在转座酶的作用下，PiggyBac转座子质粒诱导生成多能干细胞，在细胞外形、基因表达模式和表观遗传等方面均与胚胎干细胞一致。随后在人多能干细胞中再瞬间转染适量转座酶表达载体PB200PA，其表达的转座酶可使转座子表达载体在外源基因插入位点处发生无缝切除，从而获得更安全的无转录因子、无载体的可诱导高效表本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人多能干细胞中可诱导高效表达基因体系的建立，其特征在于：包括以下步骤：/n步骤一：使用无缝克隆的方式构建TRE6P-P2A-EGFP质粒；/n步骤二：构建含过表达外源基因的PiggyBac转座子质粒；/n步骤三：使用所述含过表达外源基因的PiggyBac转座子质粒和含转座基因酶的PB200PA质粒共转染人多能干细胞；/n步骤四：建立表达所述外源基因的稳定细胞株。/n

【技术特征摘要】
1.一种人多能干细胞中可诱导高效表达基因体系的建立，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一：使用无缝克隆的方式构建TRE6P-P2A-EGFP质粒；
步骤二：构建含过表达外源基因的PiggyBac转座子质粒；
步骤三：使用所述含过表达外源基因的PiggyBac转座子质粒和含转座基因酶的PB200PA质粒共转染人多能干细胞；
步骤四：建立表达所述外源基因的稳定细胞株。


2.根据权利要求1所述的一种人多能干细胞中可诱导高效表达基因体系的建立，其特征在于：使用强力霉素诱导所述外源基因的表达。


3.根据权利要求2所述的一种人多能干细胞中可诱导高效表达基因体系的建立，其特征在于：所述强力霉素的浓度为1～2ug/ml，诱导时间为20～30小时。


4.根据权利要求1或2或3所述的一种人多能干细胞中可诱导高效表达基因体系的建立，其特征在于：所述TRE6P-P2A-EGFP质粒的构建具体包括以下步骤：
步骤一：设计P2A-EGFP特异性无缝克隆引物：包括P2A-EGFP正向引物(如SEQID:1所示)和P2A-EGFP反向引物(如SEQID:2所示)，进行PCR扩增，得到P2A-EGFP片段；
步骤二：对PB-TRE6P质粒进行酶切、跑胶、纯化；
步骤三：将所述P2A-EGFP片段插入所述经步骤二处理过的PB-TRE6P质粒中，再经筛选获得所述TRE6P-P2A-EGFP质粒。


5.根据权利要求4所述的一种人多能干细胞中可诱导高效表达基因体系的建立，其特征在于：
所述P2A-EGFP片段的插入位置为所述经步骤二处理过的PB-TRE6P质粒的TRE3G启动子和3Xflag序列中间。


6.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：王永煜，权颖怡，
申请(专利权)人：温州医科大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33