一株他克莫司单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用制造技术

一株他克莫司单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于免疫检测技术领域。一株他克莫司单克隆抗体杂交瘤细胞株ICP2B3，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年11月28日，保藏编号CGMCC No.19172。本发明专利技术通过他克莫司肟化合成半抗原，制备了他克莫司完全抗原，将其与等量弗氏佐剂混合乳化完全，通过背部皮下多点注射免疫BALB/c小鼠，选取高效价、低IC

【技术实现步骤摘要】
一株他克莫司单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
本专利技术涉及一株他克莫司单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于免疫检测

技术介绍
他克莫司（Tacrolimus）是从链霉菌属中分离出的一种大环内酯类免疫抑制剂，属于钙调磷酸酶抑制剂，多用于器官移植以及肾病综合症的临床治疗。他克莫司主要是通过与蛋白FKBP-12结合，形成药物-蛋白复合物，抑制白介素-2（IL-2）的表达，并抑制T淋巴细胞的作用。虽然与环孢霉素相比，他克莫司的免疫抑制强度强和临床不良反应少，但仍存在生物利用度较低，影响因素多，以及神经系统毒性、肾毒性、血液毒性等多种不良反应。此外，他克莫司的药物治疗窗狭窄，药代动力学差异大。他克莫司药物浓度低会增加排斥反应风险，浓度过高则易导致不良反应的发生。因此，有必要建立快速、高效的他克莫司的监测方法，以便及时调整用药剂量。他克莫司含量分析方法有高效液相色谱法(HPLC)、液质联用(LC-MS)等仪器方法，这些检测方法具有耗时、步骤繁琐、无法进行现场快速检测、成本高等缺点，因此建立快速简便的他克莫司检测方法具有重要意义。酶联免疫法（ELISA）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，适用于大量样本的现场快速检测，为他克莫司检测提供了一种新的检测途径。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服上述不足之处，提供一株他克莫司单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用。本专利技术的第一个目的是提供一株他克莫司单克隆抗体杂交瘤细胞株ICP2B3，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年11月28日，保藏编号CGMCCNo.19172。本专利技术的第二个目的是提供一种他克莫司单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCCNo.19172的他克莫司单克隆抗体杂交瘤细胞株ICP2B3分泌产生。本专利技术的第三个目的是提供他克莫司单克隆抗体的应用。本专利技术的一种实施方式中，所述应用是建立他克莫司含量的免疫检测方法，用于临床血样中他克莫司浓度的监测。本专利技术的第四个目的是提供制备他克莫司免疫原的方法，所述他克莫司免疫原的制备方法基本步骤为：（1）他克莫司半抗原的制备：称取19mg他克莫司，溶解于0.6mL甲醇:水:吡啶（体积比4:1:1）混合溶液中，加入13mg羧甲基羟胺半盐酸盐（Carboxymethoxylaminehemihydrochloride，CMO），70℃水浴搅拌6h，室温避光静置过夜。随后，溶液通过氮气吹干，重悬于1mL三氯甲烷中，并用超纯水萃取三次。收集有机相，再次氮气吹干，终产物溶于1mL无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，即他克莫司半抗原。（2）免疫原他克莫司-KLH的制备：称取10mg的他克莫司半抗原将其溶解在800μLDMF中，然后加入6.3mg1-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC），5mgN-羟基琥珀酰亚胺（NHS），该混合物在室温搅拌6h；称取5mgKLH，溶解于0.1M碳酸盐缓冲液（CBS，pH9.4）中；随后，逐滴将含半抗原溶液加入到KLH溶液中，室温反应8h，即得偶联物他克莫司-KLH，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原得到免疫原他克莫司-KLH。（3）包被原他克莫司-BSA的制备：称取10mg的他克莫司半抗原，将其溶解在800μLDMF中，然后加入6.3mg1-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC，5mgN-羟基琥珀酰亚胺NHS，该混合物在室温搅拌6h；称取5mgOVA，溶解于0.1M、pH9.4碳酸盐缓冲液CBS中；随后，逐滴将含半抗原溶液加入到OVA溶液中，室温反应8h，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原得到包被原他克莫司-OVA。本专利技术的他克莫司单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选方法，主要包括以下步骤：（1）小鼠的免疫：将免疫原他克莫司-KLH与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下多点注射免疫BALB/c小鼠；首次免疫用完全弗氏佐剂，剂量为100μg/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂，剂量为50μg/只；首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，最后一次用生理盐水稀释免疫原后腹腔注射（不含佐剂）进行冲刺免疫，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天；通过间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）检测血清效价和抑制；(2)细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG4000）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过选择性培养基（HAT培养基）培养，利用间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-ELISA测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制效果的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得他克莫司单克隆抗体杂交瘤细胞株ICP2B3；(3)杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ic-ELISA测定灵敏度和特异性。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的他克莫司单克隆抗体杂交瘤细胞株ICP2B3分泌的单克隆抗体，对他克莫司具有较好的特异性和检测灵敏度（IC50值为0.996ng/mL），为检测临床上血样中他克莫司含量提供了免疫学方法。本专利技术提供的他克莫司单克隆抗体杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体可制成用于检测他克莫司的试剂盒，具有实际应用价值。生物材料样品保藏：一株他克莫司单克隆抗体杂交瘤细胞株ICP2B3，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年11月28日，保藏编号CGMCCNo.19172。附图说明图1ICP2B3单克隆抗体对他克莫司的抑制标准曲线。具体实施方式本专利技术下面的实施例仅作为本
技术实现思路
的进一步说明，不能作为本专利技术的限定内容或范围。下面通过实施例对本专利技术作进一步说明。本专利技术通过将他克莫司完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过ic-ELISA筛选细胞上清，最终得到了对他克莫司有较好特异性和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。实施例1杂交瘤细胞株ICP2B3的制备（1）完全抗原的制备：a、半抗原的合成路线如下：称取19mg他克莫司，溶解于0.6mL甲醇:水:吡啶（体积比4:1:1）溶液中，加入13mg羧甲基羟胺半盐酸盐（Carboxymethoxylaminehemihydrochloride，CMO），70℃水浴搅拌6h，室温避光静置过夜。随后，溶液通过氮气吹干，重悬于1mL三氯甲烷中，并用超纯水萃取三次。收集有机相，再次氮气吹干，终产物溶于1mL无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，即他克莫司半抗原。b、称取10mg的他克莫司半抗原将其溶解在800μLDMF中，然后加入6.3mg1-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC），5mgN-羟基琥珀酰亚胺（NHS），该混合物在室温搅拌6h；称取5mg钥孔血蓝蛋白KLH，溶解于0.1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株他克莫司单克隆抗体杂交瘤细胞株ICP2B3，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年11月28日，保藏编号CGMCC No.19172。/n

【技术特征摘要】
1.一株他克莫司单克隆抗体杂交瘤细胞株ICP2B3，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年11月28日，保藏编号CGMCCNo.19172。


2.他克莫司单克隆抗体，其特征在于：它由权利要求1所述保藏编号为CGMCCNo.19172的他克莫司单克隆抗体杂交瘤细胞株ICP2B3分泌产生。


3.他克莫司半抗原的制备方法，其特征在于：称取19mg他克莫司，溶解于0.6mL混合溶液中，加入13mg羧甲基羟胺半盐酸盐CMO，70℃水浴搅拌6h，室温避光静置过夜；随后，溶液通过氮气吹干，重悬于1mL三氯甲烷中，并用超纯水萃取三次；收集有机相，再次氮气吹干，终产物溶于1mL无水N,N-二甲基甲酰胺DMF中，即他克莫司半抗原。


4.根据权利要求3所述他克莫司半抗原的制备方法，其特征在于：所述混合溶液具体为甲醇:水:吡啶体积比为4:1:1的混合溶液。


5.免疫原他克莫司-KLH的制备方...

【专利技术属性】
技术研发人员：胥传来，姜晓倩，匡华，徐丽广，孙茂忠，刘丽强，吴晓玲，宋珊珊，胡拥明，郝昌龙，吴爱红，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32