一种人外周血NK细胞库的构建方法技术

本发明专利技术涉及一种人外周血NK细胞库的构建方法，步骤依次包括：采集人外周血，分离自体血浆，分离外周血单个核细胞并部分冻存得到NK细胞种子库，扩增NK细胞后并冻存，由外周血单个核细胞培养扩增NK后冻存或者由外周血单个核细胞分离纯化NK细胞并扩增培养后冻存，NK细胞检测，编码入库并上传细胞信息档案；本发明专利技术优点在于：构建人成体外周血NK细胞库，将人健康的或者年轻的NK细胞通过一定方法建库，是充分保存和利用现有NK细胞资源的有效方法，它为存储自体或者异体在需要采用免疫细胞治疗技术时提供有力的支持，具有重要的意义。

【技术实现步骤摘要】
一种人外周血NK细胞库的构建方法
本专利技术涉及一种细胞库的构建方法，特别涉及一种人外周血NK细胞库的构建方法。
技术介绍
19世纪80年代兴起的细胞过继免疫治疗带给了肿瘤患者新的希望。自然杀伤(naturalkiller,NK)细胞作为机体抗肿瘤的第一道防线，再加上其对肿瘤细胞的杀伤作用是由其表面抑制性受体和活化性受体的共同信号决定，所以NK细胞成为近年细胞过继免疫治疗的研究热点。虽然NK细胞在临床应用上的安全性和疗效得到肯定，但由于它仅占外周血淋巴细胞的5％-15％，当罹患肿瘤时，大多数肿瘤患者存在体内NK细胞数量下降和/或NK细胞清除癌细胞的能力下降的问题，导致自身的NK细胞分身乏术难以对抗激增的肿瘤细胞，而此时从患者外周血中分离自体NK细胞扩大培养进行过继免疫治疗也难以取得令人满意的效果，这些都为NK细胞的临床应用设置了障碍。因此，将人们健康时候的细胞存储起来，为将来不幸罹患肿瘤时备份健康就成了生活的另一种选择，而基于此的NK细胞的存储以及体外培养技术就成为一项影响NK细胞过继免疫治疗临床疗效的关键步骤，那么如何获得高纯度、高质量的NK本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人外周血NK细胞库的构建方法，其特征在于，步骤依次包括：采集人外周血，分离自体血浆，分离外周血单个核细胞并部分冻存得到NK细胞种子库，扩增NK细胞后并冻存，由外周血单个核细胞培养扩增NK后冻存或者由外周血单个核细胞分离纯化NK细胞并扩增培养后冻存，NK细胞检测，编码入库并上传细胞信息档案；/n所述的NK细胞的检测是指对NK细胞进行支原体、内毒素、表面标志物检测、细胞杀伤实验、细胞活率实验，用于判断NK细胞的扩增质量及扩增效率；/n所述的编码入库的方法是对分离并冻存的细胞按照每人一组系统编号，并将个人信息包括编码和保存位置信息统一输入计算机，用于管理和检索。/n

【技术特征摘要】
1.一种人外周血NK细胞库的构建方法，其特征在于，步骤依次包括：采集人外周血，分离自体血浆，分离外周血单个核细胞并部分冻存得到NK细胞种子库，扩增NK细胞后并冻存，由外周血单个核细胞培养扩增NK后冻存或者由外周血单个核细胞分离纯化NK细胞并扩增培养后冻存，NK细胞检测，编码入库并上传细胞信息档案；
所述的NK细胞的检测是指对NK细胞进行支原体、内毒素、表面标志物检测、细胞杀伤实验、细胞活率实验，用于判断NK细胞的扩增质量及扩增效率；
所述的编码入库的方法是对分离并冻存的细胞按照每人一组系统编号，并将个人信息包括编码和保存位置信息统一输入计算机，用于管理和检索。


2.根据权利要求1所述的一种人外周血NK细胞库的构建方法，其特征在于：用于提供所述人外周血的供者为在人外周血采集前符合献血标准的供者。


3.根据权利要求1所述的一种人外周血NK细胞库的构建方法，其特征在于：所述的采集人外周血是将人外周血采集至含枸橼酸钠抗凝剂的采血袋中。


4.根据权利要求3所述的一种人外周血NK细胞库的构建方法，其特征在于，所述的分离自体血浆的方法是：将采血袋中含枸橼酸钠抗凝剂的外周血转移至50ml离心管，配平后于4℃，1000-2800rpm离心5-20min，离心机调节升速1-9，降速1-9，取上层淡黄色液体至新的50ml离心管，置于56℃水浴锅中灭活30min后，3000-3500rpm离心3-8min收集上清得到自体血浆，置于-20℃冻存备用。


5.根据权利要求1所述的一种人外周血NK细胞库的构建方法，其特征在于，所述的分离外周血单个核细胞的方法是：将去除自体血浆后的下层红色液体按照体积量计用生理盐水对倍稀释吹打混匀后，再加入其0-2倍体积的0wt％-6wt％的羟乙基淀粉溶液，混匀后静置10-40min，缓慢地将20-25ml红色液体和/或上清液加入到含20ml淋巴细胞分离液的离心管中，使其与淋巴细胞分离液形成一个明显的分层，4℃，1800-5000rpm离心10-30min，离心机调节升速1-3，降速1-3，吸取底部红细胞的上层所有液体并转移至新的50ml离心管中，4℃，1500-3000rpm离心3-15min，离心机调节升速6-9，降速6-9；弃上清，用40ml生理盐水清洗细胞沉淀，取0.5ml细胞悬液用于细胞计数计算细胞回收率，剩余细胞悬液4℃，1500-3000rpm离心3-15min，离心机调节升速6-9，降速6-9，离心所得沉淀即为外周血单个核细胞。


6.根据权利要求5所述的一种人外周血NK细胞库的构建方法，其特征在于，所述的冻存外周血单个核细胞的方法是：将所述的外周血单个核细胞以0.5-10×107个/ml的密度进行分装冻存，冻存液的配方为10wt％DMSO+(0-10)wt％右旋糖苷+(80-90)wt％自体血浆。


7.根据权利要求1所述的一种人外周血NK细胞库的构建方法，其特征在于，所述的扩增NK细胞的方法是由外周血单个核细胞培养扩增NK细胞，其具体方法是：将获得的外周血单个核细胞接种于T175培养瓶中，补加GT-T551H3培养基，10％的自体血浆和终浓度...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晓宇，李崴，郭康合，林冠妃，蔡开婷，王岱桑，陈多峰，
申请(专利权)人：海南优尼科尔生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：海南;46