一种牙髓干细胞提取制备方法技术

本发明专利技术涉及一种牙髓干细胞提取制备方法，具体包括以下步骤：样本采集、样本运输、样本交接、样本检测、样本预处理、分离制备、原代培养、传代、冻存、细胞检测。本发明专利技术具有以下有益效果：细胞增殖分化能力强，杂细胞少，相对纯净，分离培养过程简单，工作量小，细胞爬出概率高，能够收获很大数量的间充质干细胞，满足大批量生产干细胞制品及临床应用的需要。生产干细胞制品及临床应用的需要。生产干细胞制品及临床应用的需要。

【技术实现步骤摘要】
一种牙髓干细胞提取制备方法


[0001]本专利技术涉及干细胞制备领域，尤其涉及一种牙髓干细胞提取制备方法。

技术介绍

[0002]间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是干细胞的一个研究分支，属于中胚层的一类早期未分化的多能干细胞，具有自我更新、自我复制、无限增殖及多向分化潜能等特点，主要存在于结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富，随后还发现存在于人体发生、发育过程的许多种组织中。目前,我们能够从骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等组织以及羊水、脐带血中分离和制备间充质干细胞，用得最多的是骨髓来源的间充质干细胞。但骨髓来源的间充质干细胞存在以下问题：随着年龄的老化，干细胞数目显著降低、增殖分化能力大幅度衰退；制备过程不容易质控；移植给异体可能引起免疫反应；取材时对患者有损伤，患者有骨髓疾病时不能采集，即使是健康供者，亦不能抽取太多的骨髓。这都限制了骨髓间充质干细胞临床应用，使得寻找骨髓以外其他可替代的间充质干细胞来源成为一个重要的问题。
[0003]牙髓间充质干细胞具有间充质干细胞的生物学特点，易于获得，采集时对身体无额外伤害，较人体其他间充质干细胞更具优势。
[0004]在牙齿中分离牙髓间充质干细胞，现有技术在体外培养很难进行大量的扩增，成活率低，这限制了牙髓间充质干细胞的发展。但是牙髓间充质干细胞的临床应用一个必然的前提是易于大量培养，因此优化牙髓间充质干细胞的培养有重大意义。
[0005]目前，从牙齿中分离间充质干细胞的方法主要是酶消化法。酶消化法的经济成本较高，酶的价格昂贵，通常还需配套的消化设备，消化时间长，且时间不易把控，消化时间不够，便无法得到足够数量的细胞，消化时间过久，酶对细胞有一定的损伤与老化，导致细胞贴壁能力与增殖活性不佳。另外一种用的较少的组织块贴壁法则是直接将牙髓组织加入培养基中培养，但此种方法较难爬出细胞。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种牙髓间充质干细胞的制备方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术提供的技术方案为：
[0008]一种牙髓干细胞提取制备方法，包括以下步骤：
[0009]1、样本采集：乳牙，成人智齿等松动后及时拔出，并用生理盐水清洗干净后放入装有牙齿储存液的采集瓶中；
[0010]2、样本运输：将采集瓶置于4
‑
8℃条件保存，12
‑
48小时内运送至实验室处理；
[0011]3、样本交接：样本接收人员收到样本后检查样本有无异常，登记相关信息；
[0012]4、样本检测：牙齿外观无异常，采集瓶完整，采集液无渗漏，无异常情况下交接给实验室制备人员；
[0013]5、样本预处理：从采集瓶中取出新鲜的牙齿，用镊子将牙齿在装有75％酒精的35mm培养皿中涮3
‑
5次，随后立即在3个装有生理盐水的35mm培养皿中清洗3次，洗去牙齿表面75％酒精；
[0014]6、分离：用医用无菌垫单包裹预处理后的牙齿，放在钢板上，用特定的锤子小心敲击牙齿，使牙齿稍微碎裂，用10cm眼科镊子小心取出牙髓，牙髓用生理盐水清洗1遍后用眼科弯剪剪碎，转移至15ml离心管中；
[0015]7、消化：在15ml离心管中加入0.05％～0.1％分散酶和0.05％～0.1％胶原酶IV的1：1(体积比)混合酶液0.5ml，在220rpm，37℃的摇床消化15min；消化后立即用14ml生理盐水终止，再用14ml生理盐水清洗一次，离心后弃上清；
[0016]8、原代培养：预先在35mm的培养皿中加入无血清完全培养基，将消化好的组织及细胞加入培养皿中，摇晃培养皿，将培养皿放入CO2浓度5％，温度37℃的培养箱中培养；根据细胞爬出情况，培养3
‑
5天后进行无血清完全培养基半量补液，培养8
‑
10天后进行无血清完全培养基换液；
[0017]9、传代：待细胞爬出融合度达到30％进行传代，去除培养皿中的组织，加入1
‑
3ml的生理盐水清洗1
‑
3次，以彻底去除残留的组织块；再加入0.2
‑
0.5ml的干细胞温和酶，使干细胞温和酶没过培养皿的底部，放在倒置显微镜下观察细胞，细胞开始变圆之后拍打培养皿，使得细胞悬浮分散开；加入五倍体积生理盐水中和消化，再收集细胞悬液1200
‑
1700rpm离心3
‑
8min，弃上清液，根据密度接种至含20
‑
25ml无血清完全培养基的100mm
‑
150mm培养皿中，放入CO2浓度5％，温度37℃培养箱中培养；按照细胞数量传至P3～P8代即可冻存；
[0018]10、冻存：待细胞增殖融合度达到85
‑
95％进行收获冻存，收集培养上清液，加入8
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15ml的生理盐水清洗1
‑
3次，以彻底去除残留的组织块；再加入2
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6ml的干细胞温和消化酶，使酶没过培养皿的底部，放在倒置显微镜下观察细胞，细胞开始变圆了之后轻轻拍打培养皿，使得细胞悬浮分散开；加入五倍体积培养上清液中和消化，再收集细胞悬液混匀后取样计数，细胞悬液1200
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1700rpm离心3
‑
8min，弃上清液，根据细胞数目加入干细胞冻存液重悬细胞，混匀后按每管(0.8
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1.2)x107cells/ml的细胞密度分装细胞至做好标记的2ml冻存管内，用程序降温仪进去降温后置于液氮长期储存；
[0019]11、细胞检测：待细胞增殖融合度达到85
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95％进行收获，采用血球计数板进行人工计数，利用台盼蓝染色测定活性，细胞流式检测表面标志物。
[0020]作为改进，所述步骤2中的储存液为0.9％的内含庆大霉素100单位/ml生理盐水。
[0021]作为改进，所述步骤8中的干细胞冻存液中不含二甲基亚砜，其成分为多种氨基酸、羟乙基淀粉和甘油。
[0022]作为改进，步骤1中在拔牙的过程中打麻药，拔牙后需及时用大量的生理盐水清洗表面残留的麻药。
[0023]作为改进，所述步骤6中钢板和锤子为特制，符合无菌要求。
[0024]作为改进，所述步骤7中胶原酶IV的消化能力较强，能把细胞消化，但对细胞活性有损伤；分散酶较温和，经分散酶消化的组织并未完全消化，组织接种可贴壁爬出细胞。两种酶的使用能使牙髓间充质干细胞既通过酶消化法得到部分细胞，同时组织接种法补充酶消化后活性不高的细胞，使原代的培养更容易得到大量的细胞，便于大量扩增。
[0025]本专利技术的有益效果为：
[0026]1)本专利技术针对传统的酶消化法的不足，结合了组织块贴壁法，使得原代细胞周期缩短，能够在5天看到组织块周围看到细胞爬出，8
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10天全量更换培养基，去除细小的组织碎本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种牙髓干细胞提取制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1、样本采集：乳牙，成人智齿等松动后及时拔出，并用生理盐水清洗干净后放入装有牙齿储存液的采集瓶中；2、样本运输：将采集瓶置于4
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8℃条件保存，12
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48小时内运送至实验室处理；3、样本交接：样本接收人员收到样本后检查样本有无异常，登记相关信息；4、样本检测：牙齿外观无异常，采集瓶完整，采集液无渗漏，无异常情况下交接给实验室制备人员；5、样本预处理：从采集瓶中取出新鲜的牙齿，用镊子将牙齿在装有75％酒精的35mm培养皿中涮3
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5次，随后立即在3个装有生理盐水的35mm培养皿中清洗3次，洗去牙齿表面75％酒精；6、分离：用医用无菌垫单包裹预处理后的牙齿，放在钢板上，用特定的锤子小心敲击牙齿，使牙齿稍微碎裂，用10cm眼科镊子小心取出牙髓，牙髓用生理盐水清洗1遍后用眼科弯剪剪碎，转移至15ml离心管中；7、消化：在15ml离心管中加入0.05％～0.1％分散酶和0.05％～0.1％胶原酶IV的1：1(体积比)混合酶液0.5ml，在220rpm，37℃的摇床消化15min；消化后立即用14ml生理盐水终止，再用14ml生理盐水清洗一次，离心后弃上清；8、原代培养：预先在35mm的培养皿中加入无血清完全培养基，将消化好的组织及细胞加入培养皿中，摇晃培养皿，将培养皿放入CO2浓度5％，温度37℃的培养箱中培养；根据细胞爬出情况，培养3
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5天后进行无血清完全培养基半量补液，培养8
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10天后进行无血清完全培养基换液；9、传代：待细胞爬出融合度达到30％进行传代，去除培养皿中的组织，加入1
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3ml的生理盐水清洗1
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3次，以彻底去除残留的组织块；再加入0.2
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0.5ml的干细胞温和酶，使干细胞温和酶没过培养皿的底部，放在倒置显微镜下观察细胞，细胞开始变圆之后拍打培养皿，使得细胞悬...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晓宇，王岱桑，郭康合，林冠妃，李秋宛，
申请(专利权)人：海南优尼科尔生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：