用于免疫检查点PD-1/PD-L1动态监测的标记物组合、方法及系统技术方案

本发明专利技术公开了一种用于免疫检查点PD‑1/PD‑L1动态监测的标记物组合、方法及系统。该方法采用Opal/TSA多标记免疫荧光技术在肿瘤组织中同时检测多个与肿瘤免疫相关的标志物并结合Vectra自动多光谱定量病理图像分析系统进行数据处理。本发明专利技术的方法可以对肿瘤免疫抑制剂的实际用药进行指导，在同一组织上，不同免疫检测点以及免疫细胞标志物均可检测到信号，不仅能够对细胞进行亚分型，并获得各个表型的细胞，对肿瘤患者治疗前后的疗效判断以及指导肿瘤免疫治疗提供理论依据。还可以为肿瘤免疫治疗疗效提供动态检测，更好的指导临床用药，使更多肿瘤患者能受益于免疫治疗；在检测靶点上比常规免疫组化检测技术更加丰富和更直观。

【技术实现步骤摘要】
用于免疫检查点PD-1/PD-L1动态监测的标记物组合、方法及系统
本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种用于免疫检查点PD-1/PD-L1动态监测的标记物组合、方法及系统。
技术介绍
当今社会,由于人口老龄化、生活方式和生存环境等多种因素的影响,癌症已成为全社会日益关注的焦点问题。据WHO的数据，全球范围内有1/6的人口死亡是由于罹患癌症，同时有1/2的人群会在整个生命周期中出现不同种类的肿瘤。近年来，作为肿瘤治疗新的革命性技术，免疫治疗尤其是免疫检查点治疗模式发展迅猛，多个程序性死亡受体/配体-1(PD-1/PD-L1)抑制剂在肺癌、肝癌、黑色素瘤等十几种恶性肿瘤中迅速得到临床批准。如何提高PD-1/PD-L1抑制剂的疗效，并对疗效进行精准评估和动态监测成为临床界最关注的问题。PD-1/PD-L1免疫疗法是一种当前备受瞩目的抗肿瘤疗法，旨在利用人体自身的免疫系统对抗肿瘤细胞。前者是免疫T细胞表面的一种受体，后者是癌细胞分泌的。当两者结合时，通过传递抑制信号阻止免疫T细胞活化，免疫T细胞将被窒息并促使癌细胞生长。但是，现有的通过PD-1或PD-L1蛋白抗体进行的重度免疫疗法，阻止了PD-1和PD-L1的识别，从而恢复了T细胞的正常识别和防御攻击功能，并杀死了肿瘤细胞。PD-1表达于多种肿瘤组织中的肿瘤浸润型淋巴细胞，包括头颈部癌、黑色素瘤和非小细胞肺癌(non-small-celllungcancer,NSCLC)；PD-L1也在多种恶性肿瘤中高表达，如NSCLC等。然而，PD-1/PD-L1抑制剂(如Nivolumab和Pembrolizumab等)因其在多种恶性肿瘤中临床疗效良好且患者能获得长期缓解，被认为是有潜力的抗肿瘤药物，但总体应答率仅为20-30％，且可产生获得性抵抗，以及其高发的耐药问题(包括原发性及获得性耐药)仍不容忽视。目前研究显示抗PD-1/PD-L1单抗的原发性耐药与肿瘤免疫微环境动态变化、肿瘤突变负荷及致癌通路激活等因素相关。PD-L1表达具有时空异质性，其表现为空间和时间两个方面。空间异质性表现为PD-L1表达在同一肿瘤的不同位置，这种位置的异质性意味着穿刺部位不同导致PD-L1表达检测结果不同。空间异质性还表现为肿瘤转移到不同部位后PD-L1表达也不尽相同，如肾上腺和肝脏转移灶活检组织PD-L1表达通常比较高，转移灶位于骨骼或者头颅时PD-L1表达比较低。时间异质性表现为随着病程的延长，肿瘤PD-L1表达也会发生动态变化。在治疗过程中，由于肿瘤的时空异质性，需要进行不同部位、不同治疗节点的多次基因信息检测，在临床上需进行更加精准的治疗。目前临床上主要通过影像学和肿瘤标记物进行肿瘤监测/疗效评价，但存在灵敏度和特异性不足的问题，而且单从影像学和肿瘤标记物的表达只能判断病情进展，却无法得知疾病进展的真正原因。目前，PD-L1表达水平的检测主要是通过传统免疫组织化学方法，由于存在肿瘤异质性和微小转移灶不可见的原因，原位癌组织中PD-L1检测并不能直接反映体液及转移灶中PD-L1的水平。而PD-L1表达判读涉及到多个方面，如肿瘤细胞、免疫细胞、肿瘤细胞数量、阳性强度等等。传统的免疫组化结果判读，应首先观察HE染色切片，确定肿瘤细胞的数量及在切片中的位置，然后低倍镜下观察PD-L1免疫组化切片，确定PD-L1是否阳性以及阳性的部位，最后高倍镜下观察符合要求的PD-L1染色的肿瘤细胞以及计算百分比，但是这种方法往往不能辨别阳性信号具体出现在哪个细胞。而且肿瘤患者单纯PD-L1表达水平的检测，并不能准确反映患者接受PD-1/PD-L1治疗的效果。治疗效果的差异取决于肿瘤微环境的异质性和复杂性，这反映在肿瘤细胞和肿瘤浸润的淋巴细胞(TILs)表达的免疫检查点之间的差异和相互作用。肿瘤的免疫治疗是一个动态变化的过程，是发动人体自身免疫细胞去攻击癌细胞，与人体自身的免疫系统与肿瘤的一次殊死搏斗。因此，或许真正最靠谱的预测PD-1/PD-L1抗体是否起效的办法，还是通过用药前后多次的穿刺活检取得肿瘤组织，进行详细的免疫表型分析。因此迫切需要一种新的方法，对肿瘤患者整体PD-1/PD-L1表达水平和患者免疫细胞状态进行动态监测，联合二者检测结果用于动态监测患者PD-1/PD-L1治疗的疗效，为疾病治疗方案的选择提供参考，更好的指导临床应用。mIHC可以更直观地看到肿瘤微环境中每个免疫检查点以及免疫细胞，定位、定量和相互作用，可为上述传统方法的局限性提供一些解决方案。mIHC可以同时检测同一组织切片样品上的多个免疫相关分子。这对于理解肿瘤微环境中各种细胞之间的关系，分析信号通路的上游和下游蛋白表达之间的关系，以及对于临床诊断和治疗都至关重要。通过多标记全景分析的方法，可以充分有效地研究肿瘤的微环境。mIHC的另一个好处是通过应用图像分析提高了定位的准确性，并使用了专门用于指示组织结构的界标标记。借助多光谱成像技术和定量分析软件，可以更清楚地了解肿瘤微环境中免疫检查点(如PD-L1肿瘤细胞)与TILs之间的时空分布关系。同时，通过mIHC对PD-1/PD-L1进行动态监测可了解患者对治疗药物的敏感性，及早发现耐药信号。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有技术中尚无采用mIHC的方法同时检测PD-1/PD-L1表达水平在肿瘤样本治疗前后的肿瘤细胞和TILs表达之间的差异，提出了一种用于PD-1/PD-L1动态监测的标记物组合、方法及系统。为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：第一方面，本专利技术提供一种用于免疫检查点PD-1/PD-L1动态监测的标记物组合，其特征在于：所述标记物组合由PD-1、PD-L1、CD3、CD8、CD68和CK组成。第二方面，本专利技术提供一种用于免疫检查点PD-1/PD-L1动态监测的方法，其特征在于：包括如下步骤：1)收集免疫治疗前后的石蜡包埋肿瘤样本；2)利用多色免疫荧光组织化学技术检测用于评估免疫治疗疗效的标记物组合；所述标记物组合由PD-1、PD-L1、CD3、CD8、CD68和CK组成；3)利用Vectra自动多光谱定量病理图像分析系统采集多标记的实验结果并详细分析PD-1/PD-L1相关的免疫表型；所述定量病理图像分析系统包括PerkinElmer多光谱成像设备和inForm2.4图像定量分析软件；4)根据所获得以上结果，提交PD-1/PD-L1表达状态的分子报告。作为优选方案，所述步骤1)中的肿瘤样本包括均处于中晚期的肺癌、恶性黑色素瘤、尿路上皮癌、肾癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈部和胃肠道肝胆系统的恶性肿瘤细胞。进一步地，所述步骤2)中，多色免疫荧光组织化学技术依次检测相应的PD-1/PD-L1免疫检查点和淋巴细胞、巨噬细胞标记物；在检测过程中，需要注意抗体和不同荧光染料的最佳搭配以及检测顺序。更进一步地，所述步骤3)中，采用PerkinElmer多光谱成像设备和inForm2.4图像定量分析软件详细分析PD-1/PD-L1相关的免疫表型，在阴性对照和阳性对照的协助下，可完本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于免疫检查点PD-1/PD-L1动态监测的标记物组合，其特征在于：所述标记物组合由PD-1、PD-L1、CD3、CD8、CD68和CK组成。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于免疫检查点PD-1/PD-L1动态监测的标记物组合，其特征在于：所述标记物组合由PD-1、PD-L1、CD3、CD8、CD68和CK组成。


2.一种用于免疫检查点PD-1/PD-L1动态监测的方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)收集免疫治疗前后的石蜡包埋肿瘤样本；
2)利用多色免疫荧光组织化学技术检测用于评估免疫治疗疗效的标记物组合；所述标记物组合由PD-1、PD-L1、CD3、CD8、CD68和CK组成；
3)利用Vectra自动多光谱定量病理图像分析系统采集多标记的实验结果并详细分析PD-1/PD-L1相关的免疫表型；所述定量病理图像分析系统包括PerkinElmer多光谱成像设备和inForm2.4图像定量分析软件；
4)根据所获得以上结果，提交PD-1/PD-L1表达状态的分子报告。


3.根据权利要求2所述用于免疫检查点PD-1/PD-L1动态监测的方法，其特征在于：所述步骤1)中的肿瘤样本包括均处于中晚期的肺癌、恶性黑色素瘤、尿路上皮癌、肾癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈部和胃肠道肝胆系统的恶性肿瘤细胞。


4.根据权利要求2或3所述的用于免疫检查点PD-1/PD-L1动态监测的方法，其特征在于：所述步骤2)中，多色免疫荧光组织化学技术依次检测相应的PD-1/PD-L1免疫检查点和淋巴细胞、巨噬细胞标记物；在检测过程中，需要注意抗体和不同荧光染料的最佳搭配以及检测顺序。


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【专利技术属性】
技术研发人员：陈洪雷，杨雨寒，赵晨，袁毓，田素芳，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42