直接检测血液中循环肿瘤细胞的分子信标传递体系、其制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及生物医学的技术领域，具体涉及一种直接检测血液中循环肿瘤细胞的分子信标传递体系、其制备方法及应用，直接检测血液中循环肿瘤细胞的分子信标传递体系为由高分子材料、鱼精蛋白和分子信标自组装的纳米粒子。本发明专利技术的分子信标传递体系所有材料均为生物相容性材料，在血液中直接孵育不会造成血细胞和循环肿瘤细胞的毒副效应。本发明专利技术的分子信标传递体系的纳米粒子的粒径，电位，表面形貌能满足进细胞的要求，同时纳米粒子具有良好的稳定性与生物相容性。

【技术实现步骤摘要】
直接检测血液中循环肿瘤细胞的分子信标传递体系、其制备方法及应用
本专利技术涉及生物医学的
，具体涉及一种直接检测血液中循环肿瘤细胞的分子信标传递体系、其制备方法及应用。
技术介绍
当今随着人们生活方式、生存环境和人口老龄化多方面因素影响，癌症的预防与治疗已成为我国公共卫生的重大问题。根据最新世界卫生组织数据表明，全球有大约1/6的人死于癌症。虽然恶性肿瘤极大地威胁了人们的生命健康，但早期诊断和最佳治疗可以大大地提高癌症患者的生存率。传统的临床诊断方法主要有组织活检与影像学，组织活检是通过侵入性穿刺或手术取病灶部位组织从而对肿瘤类型进行判读，该方法不仅会给患者带来侵入性伤害，同时由于肿瘤标志物滞后性造成结果假阳或假阴性；影像学可检测到的肿瘤大小仅为10000万个细胞(约1立方厘米)以上，而肿瘤在体积不足100万个细胞(约0.01立方厘米)时就已经开始转移。因此，一种作为传统检测方法的替代和补充技术---液体活检出现在人们的视野中。液体活检作为一种无创的新型检测方法，主要是通过检测实体瘤脱落入体液中的循环肿瘤细胞(Circμlatingtμmorcells,CTCs)、循环肿瘤DNA以及外泌体等,从而对患者进行早期筛查诊断、靶向用药指导、疗效动态监测和预后实时评估。由于液体活检的取样部位多样、检测的可重复性等特点，其在精准治疗方面具有极大的潜在价值。循环肿瘤细胞是指来自于外周血中各种肿瘤细胞，这些细胞从原发肿瘤上脱落，搭乘血液或淋巴系统去往身体各处，在身体里寻找新的转移灶从而导致了疾病的进展。相较于循环肿瘤DNA以及外泌体等，循环肿瘤细胞由于其包含了原发肿瘤部位全部基因信息，可以更好地反应疾病的进展。但是由于循环肿瘤细胞在血液中相对个数极少，1mL外周血中每106～107个白细胞中才发现0～100个CTCs，因此开发出一种针对循环肿瘤细胞高效检测技术尤为重要。血液中循环肿瘤细胞的检测主要是两步法：细胞富集与下游表征。细胞富集主要是根据循环肿瘤细胞其物理特性(密度，大小等)、表面抗原和表面亲和作用等，开发出的一系列诸如密度梯度离心法、膜滤过分离法、免疫磁珠细胞分选法和多肽纳米磁珠等技术方法。下游表征手段主要有RT-PCR、激光扫描技术、流式细胞术、免疫细胞化学和单细胞测序等。这种先富集后表征的检测方法的主要缺陷有：1.在富集的过程中循环肿瘤细胞容易造成损伤；2.不能实现活细胞的实时检测；3.富集后的细胞判读过分依赖于各种染色方法，导致过程繁琐，同时判段结果因其表面抗原缺失容易造成假阴性。因此开发出一种能先检测血液中的循环肿瘤细胞再对其富集的纳米材料尤为重要，已报道的类似纳米材料大多是由金属或无机非金属材料组成，生物相容性差，同时也只能通过抗体或适配体检测CTCs表面的蛋白分子，都无法检测到细胞内部的核酸分子，因此开发出一种良好的生物相容性并能实时反映细胞内部核酸表达情况的纳米材料迫在眉睫。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种直接检测血液中循环肿瘤细胞的分子信标传递体系，可以在血液环境下高效地靶向到循环肿瘤细胞，达到高效检测循环肿瘤细胞的目的。本专利技术的目的之二在于提供一种直接检测血液中循环肿瘤细胞的分子信标传递体系的制备方法，制备工艺简便，易于调节。本专利技术的目的之三在于提供一种直接检测血液中循环肿瘤细胞的分子信标传递体系的应用。本专利技术实现目的之一所采用的方案是：一种直接检测血液中循环肿瘤细胞的分子信标传递体系，为由高分子材料、鱼精蛋白和分子信标自组装的纳米粒子。本专利技术的分子信标传递体系纳米粒子中的分子信标在未遇见靶向目标时，通过荧光共振能量转移处于荧光猝灭状态。纳米粒子表面的适配体可以与循环肿瘤细胞表面过度表达的蛋白进行结合，纳米粒子通过主动靶向内吞进入细胞，在循环肿瘤细胞中溶酶体的酸性环境下解体，随即将分子信标释放到细胞质中。细胞质中的特定核酸与分子信标结合，从而引发分子信标荧光恢复。通过荧光强弱可以实时监测肿瘤细胞中核酸水平的变化。癌症病人血液中的细胞主要有血细胞和循环肿瘤细胞组成，由于红细胞和血小板没有内吞能力，纳米粒子不会进入到红细胞和血小板中。白细胞表面没有能让纳米粒子特异性识别的蛋白，纳米粒子也不会进入到白细胞中。因此纳米粒子能够实现在血液中高效检测到循环肿瘤细胞。优选地，所述高分子材料包括适配体化透明质酸、多肽化透明质酸、适配体化羧甲基壳聚糖、多肽化羧甲基壳聚糖、适配体化海藻酸钠、多肽化海藻酸钠、适配体化肝素钠、多肽化肝素钠中的任意一种，还可包括透明质酸、羧甲基壳聚糖、海藻酸钠、肝素钠中的任意一种。优选地，所述分子信标包括普通分子信标、锁定分子信标、无茎分子信标、荧光转移分子信标、CHA、HCR中的任意一种。CHA为催化发夹型DNA自组装反应(Catalyzedhairpinassembly)，HCR为杂交链式反应(Hybridizationchainreaction)。优选地，所述分子信标的5’端标记有荧光基团，3’端标记有荧光淬灭基团。所述分子信标中的荧光基团发出的荧光可以被淬灭基团淬灭，当所述分子信标与靶细胞目标物结合时，分子信标的茎环被打开，荧光基团远离淬灭基团，进而使得荧光信号可以被检测到。优选地，所述分子信标传递体系可检测的核酸包括sμrvivinmRNA，p53mRNA，EpCAMmRNA，RPL15mRNA，miR-21，miR-205中的任意一种。检测样本来自与核酸配对的单链DNA或RNA样本、细胞样本或血液样本。本专利技术实现目的之二所采用的方案是：一种所述的直接检测血液中循环肿瘤细胞的分子信标传递体系的制备方法，包括以下步骤：(1)将所述高分子材料适配体化或多肽化，得到功能化的高分子材料；(2)将一定量的鱼精蛋白溶液加去离子水配制成溶液A，将一定量的分子信标溶液加去离子水配制成溶液B，将溶液A逐滴加入溶液B中并混合均匀；(3)将所述步骤(1)中得到的功能化高分子材料加入所述步骤(2)得到的混合溶液中，继续混合均匀，即得到所述分子信标传递体系。能化生物高分子材料/鱼精蛋白/分子信标纳米粒子的合成合成原理：纳米体系通过自组装方法合成。带正电的硫酸鱼精蛋白(PS)与带负电的分子信标(MB)通过静电作用组成鱼精蛋白/分子信标纳米粒子，随后将带负电的功能化高分子材料加入到表面带正电的鱼精蛋白/分子信标纳米粒子中，随即制备成功能化生物高分子材料/鱼精蛋白/分子信标纳米粒子。优选地，所述步骤(1)的具体步骤为Ⅰ或Ⅱ中的任意一种；Ⅰ、将高分子材料溶解在PBS缓冲溶液中，再加入催化剂EDC/HoBt在室温下活化，然后加入氨基化的适配体或多肽并在室温下反应；将反应后所得产物置于透析袋中透析，冻干后得到所述功能化高分子材料；Ⅱ、将适配体或多肽溶解在PBS缓冲溶液中，用催化剂EDC/HoBt在室温下活化，然后加入高分子材料并室温下反应；将反应后所得产物置于透析袋中透析，冻干后得到所述功能化高分子材料。当高分子材料为明质酸，海藻酸钠，肝素钠本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种直接检测血液中循环肿瘤细胞的分子信标传递体系，其特征在于：为由高分子材料、鱼精蛋白和分子信标自组装的纳米粒子。/n

【技术特征摘要】
1.一种直接检测血液中循环肿瘤细胞的分子信标传递体系，其特征在于：为由高分子材料、鱼精蛋白和分子信标自组装的纳米粒子。


2.根据权利要求1所述的直接检测血液中循环肿瘤细胞的分子信标传递体系，其特征在于：所述高分子材料包括适配体化透明质酸、多肽化透明质酸、适配体化羧甲基壳聚糖、多肽化羧甲基壳聚糖、适配体化海藻酸钠、多肽化海藻酸钠、适配体化肝素钠、多肽化肝素钠中的任意一种，还可包括透明质酸、羧甲基壳聚糖、海藻酸钠、肝素钠中的任意一种。


3.根据权利要求1所述的直接检测血液中循环肿瘤细胞的分子信标传递体系，其特征在于：所述分子信标包括普通分子信标、锁定分子信标、无茎分子信标、荧光转移分子信标、CHA、HCR中的任意一种。


4.根据权利要求3所述的直接检测血液中循环肿瘤细胞的分子信标传递体系，其特征在于：所述分子信标的5’端标记有荧光基团，3’端标记有荧光淬灭基团。


5.根据权利要求1所述的直接检测血液中循环肿瘤细胞的分子信标传递体系，其特征在于：所述分子信标传递体系可检测的核酸包括sμrvivinmRNA，p53mRNA，EpCAMmRNA，RPL15mRNA，miR-21，miR-205中的任意一种。


6.一种如权利要求1-5任一项所述的直接检测血液中循环肿瘤细胞的分子信标传递体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将所述高分子材料适配体化或多肽化，得到功能化的高分子材料；
(2)将一定量的鱼精蛋白溶液加去离子水配制成溶液A，将一定量的分子信标溶液加去离子水配制成溶液B，将溶液A逐滴加入溶液B中并混合均匀；
(3)将所述步骤(1)中得到的功能化高分子材料加...

【专利技术属性】
技术研发人员：程巳雪，徐唱，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42