一种高通量测序用于植物病原真菌的大规模定量检测方法技术

本发明专利技术公开了一种高通量测序用于植物病原真菌的大规模定量检测方法。在高通量测序过程中引入了内标质粒，一次性对大规模样品中病原菌种类、丰度以及种群结构进行检测，实现1000‑10000个样品的同时检测，极大方便了大规模病原菌样品检测的需要，同时样品的检测成本也大大降低了。该发明专利技术可以用于病害在田间土壤、作物等中的定量监测，为预测和预防病害流行、传染提供可靠数据，为病害的早期预测预报提供数据支撑。因此，该方法适用于植物病害诊断和预测预报领域广泛推广应用。

【技术实现步骤摘要】
一种高通量测序用于植物病原真菌的大规模定量检测方法
本专利技术涉及真菌定量检测
，特别是涉及一种高通量测序用于植物病原真菌的大规模定量检测方法。
技术介绍
植物病害当中真菌是非常重要的一个类群，常引起植株根茎叶部病害，如腐霉菌(Pythiumsp.)引起苗腐和猝倒病、丝核菌(Rhizoctoniasp.)引起立枯病，尖孢镰(Fusariumoxysporum)、黄萎轮枝孢(Verticilliumalboatum)等引起的萎蔫、枯死等。专业人员可以通过病害症状识别、病原真菌形态和培养性状观察以及生物学特性测定等方法鉴定和鉴别病害的种类，但是，病害症状发生后的识别往往意味着病害已经发生，防治的时效性已经大打折扣，并且这种鉴定方式的准确性和可靠性在很大程度也会因人而异，对形态和生物学特性相近真菌容易造成误判，因此，对研究者的专业技能与分类知识的掌握程度等要求较高，在病害早期诊断、检疫、监测、预测预报和病害防治等方面存在着很大的局限性。分子诊断技术是植物真菌病害诊断技术的未来发展方向，各种基于PCR的分子检测技术由于具有灵敏、快速及特异等特点，传统PCR技术对模板DNA的来源没有特异性要求，扩增效率高，但扩增过程可能存在污染问题，造成假阳性风险。最后，病原菌在土壤中的密度是其是否具有致病性的衡量标准，而传统PCR技术分子诊断技术对病原菌的定量和定位仍然存在困难；当前尤其是多数量真菌的同时检测技术和定量技术的发展为该技术的完善注入了新的活力，基于荧光定量PCR定量检测技术多限于对一个目标病原真菌的检测，灵敏度高、快速、单一性强，但缺少多数量性，同时易污染，造成假阳性风险。高通量测序可以揭示样品中真菌菌群的多样性，并获得特定类群真菌在群落中的相对丰度，但是却无法根据reads估算出其绝对丰度和变化，因此，对样品中病原菌诊断存在无法准确定量的问题。
技术实现思路
本专利技术就是针对目前植物真菌病害诊断中传统诊断方法和分子诊断技术存在的问题而提供一种高通量测序用于植物病原真菌的大规模定量检测方法。本专利技术在高通量测序过程中引入了内标质粒，实现了对待测样本的定量检测，可以一次性对大规模样品中病原菌种类、丰度以及种群结构进行检测，其最大的优点在于高通量，依据测序深度的提高可以实现1000-10000个样品的同时检测，适用于农技部门对植物真菌、细菌等病害在田间土壤、作物等中的定量监测。本专利技术的一种高通量测序用于植物病原真菌的大规模定量检测方法技术方案为，在高通量测序过程中引入了内标质粒，一次性对大规模样品中病原菌种类、丰度以及种群结构进行检测，实现1000-10000个样品的同时检测。所述的一种高通量测序用于植物病原真菌的大规模定量检测方法，具体步骤为：(1)根据测定的目标植物病原菌设计、优化特异性引物作为高通量测序过程中文库制备和测序引物；特异性引物扩增目标区域可以有效识别种水平上的变异特征；(2)根据特异性引物扩增序列的长度和GC含量特点，使用随机DNA生成器设计内标序列，内标序列含有特异性引物结合位点，并将其克隆到质粒pMD-18T中，形成内标质粒；设计合成内标质粒，具有以下特征：(a)含有病原真菌特异性引物结合位点，并能利用特异性引物PCR扩增出GC含量和长度与目标病原菌基因相似的DNA片段；(b)内标质粒方便提取能够大量获得。(3)在样品基因组DNA提取之前，将恒定量的内标质粒添加到样品中，并使样品中的微生物和合成的内标DNA共分离；(4)通过PCR共扩增、共测序。收集PCR扩增样品，并等量混合即为高通量测序前处理样品，根据混样数量确定测序深度，推荐每500-1000样品混合测1G数据量。还包括，(5)测序获得的样品病原菌丰度通过引入内标reads读数进行标准化，从而定量获得测序样品中病原菌的丰度信息。在PCR共扩增过程中的引入Barcodes序列，不同样品使用不同的barcodes序列，不同PCR产物混合测样后可以通过barcodes序列对样品进行分拆。通常来讲，1000reads以上的样品测序读数即能比较准确的反映测序样品中特定病原菌的绝对丰度，因此在1G测序深度条件下即可对多达上千个微生物样品进行定量检测分析。并且伴随着测序深度的扩展，其样品数还可以进一步增加，极大方便了大规模病原菌样品检测的需要，同时样品的检测成本也大大降低了。采集测定样品，主要用于土壤中病原微生物分析，但不限于土壤、也可以是植物根、茎、叶等组织样品，推荐使用土壤基因组提取试剂盒用于样品基因组DNA提取。步骤(3)中在样品基因组DNA提取之前，按每克样品加入10-500pg内标质粒的量添加到样品中，使样品中的微生物和合成的内标DNA共分离。步骤(4)中，PCR扩增，使用病原真菌特异性引物用于样品的PCR扩增，在特异引物的正向引物的5’端引入8bp的随机DNA片段，作为barcodes序列用于测序后不同样本的分拆，不同样品使用含有不同barcode序列的正向引物，反向引物不含barcode序列。测样样品建库使用NEBUltraTMDNALibraryPrepKitforIllumina试剂盒建库方法，具体流程参考试剂盒。建库完成后对文库质量进行检测，质量合格进行上机测序。测样样品建库流程如下(使用NEBUltraTMDNALibraryPrepKitforIllumina试剂盒建库方法)：(1)DNA片段末端修复(末端补平和3'端加A尾)a)将NEBNextUltraEndPrepEnzymemix和EndRepairReactionBuffer(10X)置于冰上解冻。b)每个样品(以60μl打断的DNA片段为例)中加入以下试剂。c)使用移液器轻轻吹打或震荡混匀，并短暂离心将反应液离心至管底。d)将上述PCR管置于PCR仪，热盖设置为≥75℃，并运行以下程序：30min20℃30min65℃Holdat4℃(2)连接接头a)将NEBNextUltraBlunt/TALigaseMasterMix、LigationEnhancer和Adaptor置于冰上解冻。等上一步修复结束后直接按下表加入各反应混合物。b)使用移液器轻轻吹打或震荡混匀，并短暂离心将反应液离心至管底。c)将上述PCR管置于PCR仪，并运行以下程序：20℃15minHoldat4℃(3)磁珠纯化连接产物a)涡旋震荡混匀AgencourtAMPureXPCleanBeads。b)吸取80ul(0.8X)AgencourtAMPureXPCleanBeads至100ulPCR产物中(补水至100ul)，使用移液器吹打10次混匀。室温孵育5min。c)将反应管短暂离心并置于磁力架中静置。待溶液澄清(约5min)，移除上清。d)保持EP管处于磁力架中，加入200ul新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠。室温孵本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高通量测序用于植物病原真菌的大规模定量检测方法，其特征在于，在高通量测序过程中引入了内标质粒，一次性对大规模样品中病原菌种类、丰度以及种群结构进行检测，实现1000-10000个样品的同时检测。/n

【技术特征摘要】
1.一种高通量测序用于植物病原真菌的大规模定量检测方法，其特征在于，在高通量测序过程中引入了内标质粒，一次性对大规模样品中病原菌种类、丰度以及种群结构进行检测，实现1000-10000个样品的同时检测。


2.根据权利要求1所述的一种高通量测序用于植物病原真菌的大规模定量检测方法，其特征在于，具体步骤为：
(1)根据测定的目标植物病原菌设计、优化特异性引物作为高通量测序过程中文库制备和测序引物；
(2)根据特异性引物扩增序列的长度和GC含量特点，使用随机DNA生成器设计内标序列，内标序列含有特异性引物结合位点，并将其克隆到质粒pMD-18T中，形成内标质粒；
(3)在样品基因组DNA提取之前，将恒定量的内标质粒添加到样品中，并使样品中的微生物和合成的内标DNA共分离；
(4)通过PCR共扩增、共测序。


3.根据权利要求2所述的一种高通量测序用于植物病原真菌的大规模定量检测方法，其特征在于，(5)测序获得的样品病原菌丰度通过引入内标reads读数进行标准化，从而定量获得测序样品中病原菌的丰度信息。


4.根据权利要求2所述的一种高通量测序用于植物病原真菌的大规模定量检测方法，其特征在于，在PCR共扩增过程中的引入Barcodes序列，不同样品使用不同的barcodes序列，不同PCR产物混合测样后可以通过barcodes序列对样品进行分拆。


5.根据权利要求2所述的一种高通量测序用于植物病原真菌的大规模定量检测方法，其特征在于，步骤(3)中在样品基因组DNA提取之前，按每克样品加入10-500pg内标质粒的量添加到样品中，使样品中的微生物和合成的内标DNA共分离。


6.根据权利要求2所述的一种高通量测序用于植物病原真菌的大规模定量检测方法，其特征在于，步骤(4)中，PCR扩增，使用病原真菌特异性引物用于样品的PCR扩增，在特异引物的正向引物的5’端引入8bp的随机DNA片段，作为barcodes序列用于测序后不同样本的分拆，不同样品使用含有不同barcode序列的正向引物，反向引物不含barcode序列。


7.根据权利要求3所述的一种高通量测序用于植物病原真菌的大规模定量检测方法，其特征在于，测样样品建库使用NEBUltraTMDNALibraryPrepKitforIllumina试剂盒建库方法，建库完成后对文库质量进行检测，质量...

【专利技术属性】
技术研发人员：扈进冬，吴远征，李纪顺，魏艳丽，杨合同，陈凯，
申请(专利权)人：山东省科学院生态研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37