一种快速准确选育互作型弱感光杂交稻亲本的分子标记方法技术

本发明专利技术公开的属于农业生物工程技术领域，具体为一种快速准确选育互作型弱感光杂交稻亲本的分子标记方法，包括步骤一：分析博B和粤丰B中DTH8基因的差异，步骤二：推断DTH8为控制华南弱感光型杂交稻互作感光的主效基因，针对当前利用传统的方法选育弱感光型杂交稻不育系进展慢、效率低的问题，结合弱感光型杂交稻感光基因定位区间和已报道感光基因，通过转基因功能验证明确DTH8基因控制华南弱感光型杂交稻互作感光的生物学功能，开发了基于PCR快速准确选育互作感光型杂交稻保持系/不育系的共显性功能性分子标记，大大提高育种工作的预见性，缩短了育种周期。

【技术实现步骤摘要】
一种快速准确选育互作型弱感光杂交稻亲本的分子标记方法
本专利技术涉及农业生物工程
，具体为一种快速准确选育互作型弱感光杂交稻亲本的分子标记方法。
技术介绍
华南双季稻区，作为重要的稻作生态区之一，在我国的水稻生产中占有重要的地位。在该稻作区晚季阳光充足，但由于前期气温高，后期温度相对较低，常会遭遇寒露风，对水稻产量和品质会造成一定的影响。弱感光型杂交稻作为华南稻区主要的生态类型之一，在晚造前期高温促进生长而缩短生育期，对生育后期的低温或寒露风也具有较好的耐寒性，充分利用了晚季中后期丰富的光热资源，既保证了高产稳产，又有利于稻米品质的提高。因此，弱感光型杂交稻在华南双季稻区晚季一直保持较大的种植面积。互作型弱感光杂交稻是我国南方稻区特殊杂交稻组合，由本身不感光但杂种表现互作感光的杂交稻不育系，如博A、秋A等与不同恢复系组配而成，如博优998、博优122，秋优998等。但如今博A系列组合在抗性、产量和米质等难以满足市场要求；秋A系列组合由于柱头小活力低，对“九二0极其敏感，繁制种易受温湿度高低影响，致使产量低，限制了其在杂交稻生产中的扩大应用。因此加快培育优质互作弱感光型杂交稻不育系对于提高华南双季稻区晚稻产量和品质，保证粮食生产安全具有十分重大的意义。互作感光型杂交稻不育系/保持系本身是感温型品种，早晚季均能正常抽穗，感光特性不能被识别。而只有与恢复系组配出的杂种F1代才表现出感光特性。传统的互作感光型不育系的选育过程大致如下：由具有互作感光特性的保持系亲本与具有优异农艺性状的保持系杂交，创制分离世代，然后将选育到的农艺性状优良的稳定后代与感光特性测验种杂交，待第二年早季种植杂种检验感光性，将不感光杂种对应的入选单株，保留测交F1具感光特性的杂种对应的入选单株，然后再选择与优良不育系进行回交转育，最终育成新的不育系和对应的保持系。可见，这类不育系的选育无法根据植株表现鉴别是否携带有互作感光基因进行选育，育种效率低，周期长，严重制约了这类杂交稻亲本的选育进程。分子标记辅助选择可以从分子水平上快速准确地分析个体的遗传组成，从而实现对基因型的直接选择，近些年来已经在育种上逐步得到了广泛的推广应用。尽管Hd1，DTH8，Ghd7，DTH7等效应较大的感光基因已被克隆，但是对于华南互作感光型不育系的选育，目前还没有已报道的可用分子标记。应用传统的方法选育含有互作感光基因的三系水稻不育系难度大，周期长，主要由于这种杂交稻亲本本身早晚季均能正常抽穗，感光特性不能被识别。而只有与恢复系组培出的杂种F1代才表现出感光性。因此，本专利技术提出一种快速准确选育互作型弱感光杂交稻不育系的分子标记方法，加快华南弱感型杂交稻不育系的选育。
技术实现思路
本部分的目的在于概述本专利技术的实施方式的一些方面以及简要介绍一些较佳实施方式。在本部分以及本申请的说明书摘要和专利技术名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和专利技术名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本专利技术的范围。本专利技术的目的在于提供一种快速准确选育互作型弱感光杂交稻亲本的分子标记方法，利用该共显性标记，通过PCR扩增后电泳检测可明显区分具有功能的感光基因DTH8和一种DTH8功能缺失型的DTH8等位基因。对三系杂交稻亲本的感光特性进行定向选择，不需要通过与测验亲本测交来辨别是否携带有感光基因，育种周期短，效率高。为解决上述技术问题，根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了如下技术方案：一种快速准确选育互作型弱感光杂交稻亲本的分子标记方法，其包括如下步骤：步骤一：分析博B和粤丰B中DTH8基因的差异，根据DTH8的参考基因组序列，在DTH8基因编码区的两端设计引物分别扩增博B和粤丰BDTH8基因，经测序比对后发现，博B中含有一个完整的DTH8基因全长，而在粤丰B基因组中从DTH8基因编码区的第793个碱基开始缺失至3`端，一共缺失1110个碱基；步骤二：推断DTH8为控制华南弱感光型杂交稻互作感光的主效基因，根据研究团队之前对华南稻区互作感光基因的初定位结果，以及现有感光基因的文献报道，我们推断杂交稻亲本保持系中的互作感光基因为DTH8基因，该基因编码一个结合CCAAT盒的转录因子蛋白复合体HAP3H的亚基，是主效感光基因；步骤三：再经转基因功能验证，证明推断的准确性，运用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建DTH8基因编辑载体，设计DTH8编码区起始密码子附近作为基因编辑靶位点(GTTAGCTTCACATGAAGAGTAGG)，将这段序列插入Target位置，形成DTH8基因编辑的重组载体，通过农杆菌介导的转基因方法，将这个DTH8基因编辑载体转化至DTH8功能正常的亲本博B中；步骤四：开发用于互作弱感光型杂交稻亲本选育的共显性功能性分子标记，根据博B和粤丰DTH8的测序比对结果，设计了弱感光型杂交稻亲本选育的功能性分子标记(DTH8-F:CAGGAGTGCGTGTCGGAGT；DTH8-R:TCCGTTGCCTCCTTGCTG)，该标记跨过了粤丰B中DTH8缺失的1110bp，在博B中扩增目标带为2021bp，在粤丰B中扩增目标带为911bp，双亲之间相差1110bp，因此运用琼脂糖凝胶电泳只需要1.5％的胶浓度，电泳145V运行30min就能够很好的区分双亲及杂种，表明运用开发的DTH8共显性功能行分子标记能够快速、准确的检测感光单株与非感光单株；步骤五：利用DTH8分子标记进行互作弱感光型杂交稻亲本选育，将互作感光型保持系博B作为DTH8基因的供体，导入感温型优质香型保持系粤丰B中，获得优质互作感光型保持系。作为本专利技术所述的一种快速准确选育互作型弱感光杂交稻不育系的分子标记方法的一种优选方案，其中：所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：针对当前利用传统的方法选育弱感光型杂交稻不育系进展慢、效率低的问题，结合弱感光型杂交稻感光基因定位区间和已报道感光基因，通过转基因功能验证明确DTH8基因控制华南弱感光型杂交稻互作感光的生物学功能，开发了基于PCR快速准确选育互作感光型杂交稻保持系/不育系的共显性功能性分子标记，大大提高育种工作的预见性，缩短了育种周期。利用本专利技术开发的DTH8功能性分子标记，将来源于博B的DTH8基因，经世代选育导入至感温型优质软香型保持系粤丰B中，使其改良成了优质互作感光型保持系，并通过多次回交获得相应的不育系。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施方式的技术方案，下面将结合附图和详细实施方式对本专利技术进行详细说明，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：图1为本专利技术步骤流程图；图2为本专利技术博B和粤丰DTH8序列差异结构示意图；图3为本专利技术DTH8基因编辑载体及DTH8突变类型结构示意图；图4为本专利技术DTH8功能标记胶图；图5为本专利技术突变体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速准确选育互作型弱感光杂交稻亲本的分子标记方法，其特征在于：包括如下步骤：/n步骤一：分析博B和粤丰B中DTH8基因的差异。根据DTH8的参考基因组序列，在DTH8基因编码区的两端设计引物分别扩增博B和粤丰B基因组中的DTH8基因，经测序比对后发现，博B中含有一个完整的DTH8基因全长，而在粤丰B基因组中从DTH8基因编码区的第793个碱基开始缺失至3`端，一共缺失1110个碱基；/n步骤二：推断DTH8为控制华南弱感光型杂交稻互作感光的主效基因。根据研究团队之前对华南稻区互作感光基因的初定位结果，以及现有感光基因的文献报道，我们推断杂交稻亲本保持系/不育系中的互作感光基因为DTH8基因，该基因编码一个结合CCAAT盒的转录因子蛋白复合体HAP3H的亚基，是主效感光基因；/n步骤三：再经转基因功能验证，证明推断的准确性。运用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建DTH8基因编辑载体，设计DTH8编码区起始密码子附近作为基因编辑靶位点(GTTAGCTTCACATGAAGAGTAGG)，构建DTH8基因编辑的重组载体，通过农杆菌介导的转基因方法，将DTH8基因编辑载体转化至DTH8功能正常的亲本博B中；/n步骤四：开发用于互作弱感光型杂交稻亲本选育的共显性功能性分子标记。根据博B和粤丰DTH8的测序比对结果，设计了弱感光型杂交稻亲本选育的功能性分子标记(DTH8-F:CAGGAGTGCGTGTCGGAGT；DTH8-R:TCCGTTGCCTCCTTGCTG)，该标记跨过了粤丰B中DTH8缺失的1110bp，在博B中扩增目标带为2021bp，在粤丰B中扩增目标带为911bp，双亲之间相差1110bp，因此运用琼脂糖凝胶电泳只需要1.5％的胶浓度，电泳145V运行30min就能够很好的区分双亲及杂种，结果表明运用开发的DTH8共显性功能行分子标记能够快速、准确的检测感光单株与非感光单株；/n步骤五：利用DTH8分子标记进行互作弱感光型杂交稻亲本选育。将互作感光型保持系博B作为DTH8基因的供体，导入感温型优质香型保持系粤丰B中，获得优质互作感光型保持系。/n一种快速准确选育互作型弱感光杂交稻不育系的分子标记方法，其特征在于：所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。/n...

【技术特征摘要】
1.一种快速准确选育互作型弱感光杂交稻亲本的分子标记方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤一：分析博B和粤丰B中DTH8基因的差异。根据DTH8的参考基因组序列，在DTH8基因编码区的两端设计引物分别扩增博B和粤丰B基因组中的DTH8基因，经测序比对后发现，博B中含有一个完整的DTH8基因全长，而在粤丰B基因组中从DTH8基因编码区的第793个碱基开始缺失至3`端，一共缺失1110个碱基；
步骤二：推断DTH8为控制华南弱感光型杂交稻互作感光的主效基因。根据研究团队之前对华南稻区互作感光基因的初定位结果，以及现有感光基因的文献报道，我们推断杂交稻亲本保持系/不育系中的互作感光基因为DTH8基因，该基因编码一个结合CCAAT盒的转录因子蛋白复合体HAP3H的亚基，是主效感光基因；
步骤三：再经转基因功能验证，证明推断的准确性。运用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建DTH8基因编辑载体，设计DTH8编码区起始密码子附近作为基因编辑靶位点(GTTAGCTTCACATGAAGAGTAGG)，构建DTH8基因编辑的重组载体，通过农杆菌介导的...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾学勤，王丰，柳武革，李金华，刘迪林，廖亦龙，朱满山，付崇允，马晓智，霍兴，
申请(专利权)人：广东省农业科学院水稻研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44