检测幽门螺杆菌耐药基因突变的方法及试剂盒技术

本发明专利技术提供了检测幽门螺杆菌耐药基因突变的方法及试剂盒，具体的本发明专利技术基于多重PCR‑飞行时间质谱检测5种常用的幽门螺杆菌抗生素（包括克拉霉素、甲硝唑、喹诺酮类、阿莫西林和四环素）的耐药基因位点变异，并提供了配套引物、探针组合及试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
检测幽门螺杆菌耐药基因突变的方法及试剂盒
本专利技术属于生物
，具体地说，本专利技术涉及一种用于幽门螺旋杆菌耐药基因突变检测的试剂盒。
技术介绍
幽门螺杆菌（H.pylori）是定植于胃上皮细胞的微需氧革兰氏阴性细菌，感染了世界约50％至70％的人口，有些发展中国家感染率甚至高达80%以上，是全球最普遍的病原体之一，可导致胃肠道疾病，包括消化性溃疡、胃边缘区/黏膜相关淋巴样组织（MALT）淋巴瘤和胃癌。幽门螺杆菌已被世界卫生组织和国际癌症研究机构（IARC）定为I类致癌物。据统计，全世界超过6％的癌症和大约90％的非贲门型胃癌病例均归因于幽门螺杆菌感染。根据世界卫生组织（WHO）资料，2018年因感染引发的癌症占24.2％，其中45%归因为Hp感染。根除幽门螺杆菌将显着降低胃癌和消化性溃疡的发生率，并降低与控制这些发病率相关的成本，尤其在高流行人群中，根除幽门螺杆菌具有明显成本效益。目前，幽门螺杆菌的根除方案主要包括质子泵抑制剂（PPI）、胃粘膜保护剂和一种或两种抗生素，构成三联或四联疗法。用于根除幽门螺杆菌的抗生素包括克拉霉素、甲硝唑、喹诺酮类（左氧氟沙星）、阿莫西林、四环素、利福平等。在1990年代初，根除幽门螺杆菌的比率超过80％。但是近年来，随着全球幽门螺杆菌菌株对最常用抗生素的细菌耐药性不断增加，在过去20年中，许多国家的抗生素耐药性已超过15-20％的门槛，克拉霉素、阿莫西林和甲硝唑的耐药性水平最高分别达50％、30％和95％。多药耐药性的出现显著影响幽门螺杆菌根除标准疗法的疗效，导致幽门螺杆菌的根除率在全球范围内不断下降。为了最好地优化幽门螺杆菌感染的管理，幽门螺杆菌的治疗应基于局部和个体抗菌素耐药性模式，针对具体患者量身定制有效的抗生素治疗策略可能会大大减少治疗失败并降低抗生素耐药性。在耐药性检测方面，内窥镜引导的幽门螺杆菌培养和表型药敏试验（DST）是检测耐药性的金标准技术。但由于需要进行侵入式内窥镜检查才能从患者那里获得胃活检标本，并且幽门螺杆菌运输和培养均需要严格的条件，难度较大且很费时，至少需要10天才能完成细菌培养和抗生素敏感性测试，既费时又费钱，因此不建议在进行一线治疗之前进行完整的表型DST。随着分子检测技术的不断发展和完善，分子检测在病原微生物感染诊断及治疗监测上的临床应用日益广泛，可以作为培养法药敏试验的一种有效替代方法。目前常用的病原微生物分子检测方法主要包括：基于PCR的电泳法、实时荧光定量PCR（qPCR）、基因芯片技术、测序技术（Sanger测序技术、焦磷酸测序技术、高通量NGS测序技术）等。PCR是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，具有灵敏度高、特异性强、简便快速、对标本的纯度要求低等特点，是目前应用最为广泛的病原学检测技术。目前用于确定幽门螺杆菌抗性的分子检测方法主要包括限制性片段长度多态性PCR（PCR-RFLP）、荧光原位杂交（fluorescenceinsituhybridization，FISH）、实时荧光定量PCR和等位基因特异性PCR等，检测样本包括活检标本、胃液、菌落甚至粪便，这些方法在检测23SrRNA和gyrA基因突变以预测克拉霉素和左氧氟沙星耐药性方面显示了良好的灵敏度和特异性。中国专利CN109797203A“幽门螺杆菌检测体系及检测试剂盒和应用”和CN111334592A“一种用于检测幽门螺杆菌耐药基因的核酸组合物及其试剂盒和应用”分别公开了用于幽门螺杆菌的鉴定、分型及抗生素耐药性的荧光定量PCR扩增体系，但是目前荧光定量PCR法由于本身的技术性限制，一个检测反应最多只能实现几个位点的同时检测，检测通量有限，当需要检测更多种基因变异点位时就会受到限制。另一方面，利用常规的荧光定量PCR方法可能无法满足大样本量快速检测的需求。中国专利CN105368825A“幽门螺杆菌抗生素耐药性分析试剂盒及耐药性检测方法”和CN105506160A“幽门螺杆菌定量和毒力多重基因检测体系及其试剂盒和应用”均公开了一种基于多重PCR-毛细管电泳法在同一个反应体系内对幽门螺杆菌常用抗生素耐药性的分析，但是毛细管电泳法只能根据片段大小进行分型，对多重PCR扩增的均一性和特异性具有很高的要求。NGS高通量测序技术和芯片技术，近年来作为一种高通量高精度的核酸检测技术，由于无需对病原体进行分离培养，打破了传统微生物检验的局限性，在临床微生物学研究领域展现了广阔的应用前景。中国专利CN103060455B“一种幽门螺杆菌感染个体化治疗检测基因芯片及应用”公开了是一种用于幽门螺杆菌感染个体化治疗的检测型基因芯片，可同时对人基因组CYP4502C19*2、CYP4502C19*3多态性和幽门螺杆菌克拉霉素、喹诺酮类耐药位点进行检测。但是由于芯片检测和高通量测序（下一代和第三代测序）的设备和流程复杂昂贵，检测成本高，耗时长，目前主要用于基因型和表型耐药性之间的关联性研究方面，在幽门螺杆菌临床分子检测中很少使用。因此，如何有效利用核酸分子检测的手段，快速、高效、高通量、且准确判断幽门螺杆菌耐药情况是迫切需要解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用多重PCR-飞行时间质谱检测43个幽门螺旋杆菌耐药位点的方法、配套引物/探针组合及试剂盒、以及这种检测方法在临床耐药方面的应用，以便高效、准确地对幽门螺旋杆菌临床耐药菌株进行鉴定，能够极大的节省时间、和费用，使用极少的样本为临床提供更多更准确的诊断信息。本专利技术的第一方面，提供了一种利用多重PCR-飞行时间质谱检测幽门螺旋杆菌耐药位点的试剂盒，所述试剂盒包括第一引物对组，所述第一引物对组包括序列如SEQIDNO.1至SEQIDNO.42所示的引物。在另一优选例中，所述试剂盒还包括第二引物对组，所述第二引物对组包括序列如SEQIDNO.43至SEQIDNO.64所示的引物。在另一优选例中，所述试剂盒还包括第三引物对组，所述第三引物对组包括序列如SEQIDNO.65至SEQIDNO.76所示的引物。在另一优选例中，所述试剂盒还包括第四引物对组，所述第四引物对组包括序列如SEQIDNO.77至SEQIDNO.86所示的引物。在另一优选例中，所述试剂盒还包括第一探针组，所述第一探针组包括序列如SEQIDNO.87至SEQIDNO.107所示的探针。在另一优选例中，所述试剂盒还包括第二探针组，所述第二探针组包括序列如SEQIDNO.108至SEQIDNO.118所示的探针。在另一优选例中，所述试剂盒还包括第三探针组，所述第三探针组包括序列如SEQIDNO.119至SEQIDNO.124所示的探针。在另一优选例中，所述试剂盒还包括第四探针组，所述第四探针组包括序列如SEQIDNO.125至SEQIDNO.129所示的探针。在另一优选例中，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内含有所述第一引物对组。在另一优选例中，所述试剂盒包括第二容器，所述第二容器内含有所述第二引物对组。在另一优选例中，所述试剂盒包括第三容器，所述第三容器内含有所述第三引物对组。<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用多重PCR-飞行时间质谱检测幽门螺旋杆菌耐药位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第一引物对组，所述第一引物对组包括序列如SEQ ID NO.1至SEQ IDNO.42所示的引物。/n

【技术特征摘要】
1.一种利用多重PCR-飞行时间质谱检测幽门螺旋杆菌耐药位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第一引物对组，所述第一引物对组包括序列如SEQIDNO.1至SEQIDNO.42所示的引物。


2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第二引物对组，所述第二引物对组包括序列如SEQIDNO.43至SEQIDNO.64所示的引物；和/或
所述试剂盒还包括第三引物对组，所述第三引物对组包括序列如SEQIDNO.65至SEQIDNO.76所示的引物；和/或
所述试剂盒还包括第四引物对组，所述第四引物对组包括序列如SEQIDNO.77至SEQIDNO.86所示的引物。


3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第一探针组，所述第一探针组包括序列如SEQIDNO.87至SEQIDNO.107所示的探针。


4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第二探针组，所述第二探针组包括序列如SEQIDNO.108至SEQIDNO.118所示的探针；和/或
所述试剂盒还包括第三探针组，所述第三探针组包括序列如SEQIDNO.119至SEQIDNO.124所示的探针；和/或
所述试剂盒还包括第四探针组，所述第四探针组包括序列如SEQIDNO.125至SEQIDNO.129所示的探针。


5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第一容器，所述第一容器内含有所述第一引物对组；
所述试剂盒还包括第二容器，所述第二容器内含有所述第二引物对组；
所述试剂盒还包括第三容器，所述第三容器内含有所述第三引物对组；和/或
所述试剂盒还包括第四容器，所述第四容器内含有所述第四引物对组。


6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第五容器，所述第五容器内含有所述第一探针组；
所述试剂盒还包括第六容器，所述第六容器内含有所述第二探针组；
所述试剂盒还包括第七容器，所述第七容器内含有所述第三探针组；
所述试剂盒还包括第八容器，所述第八容器内含有所述第四探针组。


7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括虾碱性磷酸酶（SAP）。


8.一种利用多重PCR-飞行时间质谱检测幽门螺旋杆菌耐药位点的方法，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：王冬，郭金海，刘淑君，王春香，
申请(专利权)人：北京健为医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11