一种基于全长小亚基核糖体RNA的反转录来分析微生物群落结构的方法技术

本发明专利技术涉及一种基于全长小亚基核糖体RNA的反转录来分析微生物群落结构的方法，包括以下步骤：(1)快速提取样品中的总RNA；(2)在RNA的5’端加第一接头序列；(3)在能够覆盖真核和原核生物的通用反向引物的5’端加第二接头序列，用于反转录小亚基核糖体RNA；(4)在反转录产物中筛选核糖体SSU cDNA；(5)进行PCR扩增，获得双链全长核糖体SSU cDNA，对扩增产物进行测序，并提取出全长SSU rRNA序列；(6)根据所得全长SSU rRNA序列确定准确的分类信息，获得精细的微生物群落结构。与现有技术相比，本发明专利技术不使用“通用”正向引物，减少PCR过程产生的偏差，能够得到常规“通用”引物PCR扩增遗漏的微生物，并同时分析细菌、古生菌和真核微生物的整体群落结构等。

【技术实现步骤摘要】
一种基于全长小亚基核糖体RNA的反转录来分析微生物群落结构的方法
本专利技术属于生物分析
，涉及一种基于全长小亚基核糖体RNA的反转录来分析微生物群落结构的方法。
技术介绍
分离培养是研究环境微生物种类和其组成的传统技术，但是大部分微生物在实验室条件无法被分离，环境微生物研究遇到了瓶颈。随着测序技术的发展，尤其是下一代测序技术的普及，使得科学家们可通过不依赖培养的技术研究环境微生物的分类和组成。常用的技术是通过“通用”引物扩增SSUrRNA基因，高通量测序，通过后续的序列处理和分析，揭开环境微生物的群落结构。但是，此方法使用的“通用”引物具有偏向性和覆盖度问题，导致扩增时偏好于某些类别的微生物或会遗漏一些微生物。例如，地球微生物组计划中经过改进的515F/806R是我们最常用的分析环境微生物多样性的引物，但是其在对宏基因组数据的引物评估中仍然有9.6％的错配率(loe-Fadrosh,E.,Ivanova,N.,Woyke,T.etal.(2016).Metagenomicsuncoversgapsinamplicon-baseddetectionofmicrobialdiversity.NatMicrobiol1,15032.)；此外，随着高通量测序技术的发展，对这些扩增产物的现在常用的是第二代高通量测序平台，其读长不超过600bp，所得SSUrRNA基因序列的分类不够准确；并且，常规微生物群落结构分析一般是针对样本中提取的DNA进行PCR扩增，不能够区分环境中真正活着的微生物和死去的微生物。在以往的研究中，李晓然等(Li,X.R.,Lv,Y.,Meng,H.,Gu,J.D.,andQuan,Z.X.(2014).Analysisofmicrobialdiversitybypyrosequencingthesmall-subunitribosomalRNAwithoutPCRamplification.ApplMicrobiolBiotechnol98(9),3777-3789.)通过SROP(Small-subunitRibosomalRNAwithOutspecificPCRamplification)的群落结构的分析方法，避开了“通用”引物的影响，鉴定群落中的活性微生物，提高了群落结构分析的准确度(相关专利号：ZL201010132091.6)，但极高的起始微生物RNA量，序列起始位点不固定和分类序列长度制约了其广泛的应用；阎勇伟等(Yan,Y.W.,Zou,B.,Zhu,T.,Hozzein,W.N.,andQuan,Z.X.(2017).ModifiedRNA-seqmethodformicrobialcommunityanddiversityanalysisusingrRNAindifferenttypesofenvironmentalsamples.PLoSOne12(10),e0186161.)通过在RNA的5’端加接头后用加另一接头随机引物反转录SSUrRNA，并用基于两端的接头序列设计引物来进行PCR扩增的方法，进一步解决了转录组分析群落结构需要高起始RNA，序列起始位点不固定的问题，但是可用分类序列长度仍然不超过600bp。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了提供一种基于全长小亚基核糖体RNA的反转录来分析微生物群落结构的方法，不使用特异性PCR正向引物，减少PCR过程产生的偏差，能够得到常规“通用”引物PCR扩增遗漏的微生物，同时分析细菌、古生菌、真核微生物的群落结构，从而更全面地反映环境样品中微生物群落结构的特征。反转录引物的选择上，我们通过对SILVA数据库的引物评价，证实了1492R了作为反转录全长SSUrRNA反向引物的可行性，其对各类覆盖度为：细菌95.5％，古生菌93.9％，真菌83.2％，整体覆盖度达95.1％；对比MKarst等人(KarstSM,DueholmMS,McIlroySJ,KirkegaardRH,NielsenPH,AlbertsenM.(2018).Retrievalofamillionhigh-quality,full-lengthmicrobial16Sand18SrRNAgenesequenceswithoutprimerbias.NatBiotechnol36(2):190-5.)在研究中发现的常用来扩增接近全长细菌的SSUrRNA基因序列的引物对27F/1391R或1492R，不覆盖的细菌高达14.7％，常用来扩增古生菌的SSUrRNA基因序列的引物对20F/Uni1392R，不覆盖的古生菌高达13.3％，单端引物1492R的覆盖提升明显，覆盖细菌且长度更长，分类分辨率更高。而且，因多循环扩增中所用的是基于接头序列设计的引物，所以可降低多循环PCR扩增中不同类型微生物之间的偏向性。本专利技术为了进一步解决分类序列长度不够的问题，在RNA的5’端加接头，并用覆盖真核，细菌和古生菌的“通用”引物1492R(但不限于此通用引物，也可以为1390R等其它通用引物)作为了反转录引物，转录全长的SSUrRNA序列，借助基于两端接头序列设计的引物扩增之后，借助PacBio第三代测序技术，通过CircularConsensusSequence(CCS)策略，一条序列循环测序多次的方式，降低测序的错误率，获得准确度在Q30以上，即准确度99.9％以上的序列，在全长的水平和数据库比对，获得准确的分类信息。本专利技术设计了一种基于总RNA的，构建全长SSUrRNA文库，并结合PacBio三代测序技术；以解决1)常规微生物群落结构分析中“通用”引物偏向性和覆盖度问题；2)部分微生物信息被遗漏问题；3)分类准确度不够的问题；4)活性微生物和死亡微生物难辨的问题。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：本专利技术提供了一种基于全长小亚基核糖体RNA的反转录来分析微生物群落结构的方法，包括以下步骤：(1)快速提取待分析样品中的总RNA；(2)在RNA的5’端加接头序列(即第一接头序列)；(3)在能够覆盖真核和原核生物的1492R引物5’端加一段另一种接头序列(即第二接头序列)，使得1492R引物与该接头序列(即第二接头序列)组成反转录引物，并用于反转录小亚基核糖体RNA(SSUrRNA)；(4)在反转录产物中筛选核糖体SSUcDNA；(5)以前端接头序列(即第一接头序列)一部分为正向引物序列、另一接头序列(即第二接头序列)为反向引物序列进行PCR扩增，获得双链全长核糖体SSUcDNA，对扩增产物进行测序，并提取出全长SSUrRNA序列；(6)根据所得全长SSUrRNA序列确定分类信息，获得准确的微生物群落结构，同时，还可以得到分类信息未知的序列。进一步的，步骤(2)中，加接头序列(第一接头序列)所用的接头为Illumina测序通用接头，优选为Gnomegen公司RNA建库试剂盒提供的58nt的Illumina测序通用接头，接头上一段序列作为正向引物序列。进一步的，步骤(3)中，设计本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于全长小亚基核糖体RNA的反转录来分析微生物群落结构的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)快速提取待分析样品中的总RNA；/n(2)在RNA的5’端加第一接头序列；/n(3)在能够覆盖真核和原核生物的通用反向引物的5’端加第二接头序列，使得通用反向引物与第二接头序列组成反转录引物，并用于反转录小亚基核糖体RNA；/n(4)在反转录产物中筛选核糖体SSU cDNA；/n(5)以第一接头序列一部分为正向引物序列、第二接头序列为反向引物序列进行PCR扩增，获得双链全长核糖体SSU cDNA，对扩增产物进行测序，并提取出全长SSU rRNA序列；/n(6)根据所得全长SSU rRNA序列确定准确的分类信息，获得精细的微生物群落结构。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于全长小亚基核糖体RNA的反转录来分析微生物群落结构的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)快速提取待分析样品中的总RNA；
(2)在RNA的5’端加第一接头序列；
(3)在能够覆盖真核和原核生物的通用反向引物的5’端加第二接头序列，使得通用反向引物与第二接头序列组成反转录引物，并用于反转录小亚基核糖体RNA；
(4)在反转录产物中筛选核糖体SSUcDNA；
(5)以第一接头序列一部分为正向引物序列、第二接头序列为反向引物序列进行PCR扩增，获得双链全长核糖体SSUcDNA，对扩增产物进行测序，并提取出全长SSUrRNA序列；
(6)根据所得全长SSUrRNA序列确定准确的分类信息，获得精细的微生物群落结构。


2.根据权利要求1所述的一种基于全长小亚基核糖体RNA的反转录来分析微生物群落结构的方法，其特征在于，步骤(2)中，第一接头序列中的一段作为正向引物匹配序列。


3.根据权利要求1所述的一种基于全长小亚基核糖体RNA的反转录来分析微生物群落结构的方法，其特征在于，步骤(3)中，设计反转录引物时，在通用反向引物序列的5’端添加一段第二接头序列，并在通用反向引物序列与第二接头序列的中间添加三个碱基。


4.根据权利要求1所述的一种基于全长小亚基核糖体RNA的反转录来分析微生物群落结构的方法，其特征在于，步骤(4)中，采用磁珠根据长度筛选全长核糖体SSUcDNA。


5.根据权利要求1所述的一种基于全长小亚基核糖体RNA的反转录来分析微生...

【专利技术属性】
技术研发人员：全哲学，张汝毅，阎永伟，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海;31