一种用于测定IL-4靶向治疗性抗体生物学活性的方法技术

本发明专利技术公开了一种用于测定IL‑4靶向治疗性抗体生物学活性的方法，该方法包括：将载体pSecCAG‑hSTAT6‑hygro和pGL4‑5×STAT6‑luc‑puro依次转染到HEK293细胞中，构建得到稳定细胞株HEK293‑hSTAT6/5×STAT6‑luc；用IL‑4刺激激活hSTAT6/5×STAT6‑luc报告基因的表达，并用IL‑4靶向治疗性抗体阻断IL‑4信号通路，根据测定的报告基因信号值拟合四参数曲线确定抗体的生物学活性，该方法操作简便、周期短、成本低，结果稳定可靠、准确度高，对IL‑4靶向治疗性抗体药物的质量控制和临床应用具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种用于测定IL-4靶向治疗性抗体生物学活性的方法
本专利技术属于生物药物的活性检测领域，具体而言，本专利技术涉及一种用于测定IL-4靶向治疗性抗体生物学活性的方法。
技术介绍
单克隆抗体作为全球医药市场的重要组成部分，在治疗肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反应等多种疾病方面具有广阔的应用前景。单抗类药物一般相对分子质量大，并且具有结构多样性和可变性等特点，结构的细微变化将会影响药物的活性和质量，单纯的理化分析不能满足单抗类药物质量评价的需要，作为生物技术药物特殊检测方法的生物学活性检测方法可以对药物的有效成分、含量以及药物效价进行评定，是确保抗体类药物有效性的重要质控指标。目前生物学活性检测方法多采用基于细胞的生物活性测定方法，包括细胞增殖抑制法、细胞毒性法、补体依赖的细胞毒法、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性法、细胞ELISA法和报告基因法。Dupilumab(商品名Dupixent)是一种靶向IL-4受体的单克隆抗体药物，于2017年3月28日首次获得FDA批准，Dupilumab可以结合IL-4和IL-13共同的受体模块IL-4Rα，同时阻断IL-4和IL-13信号及其介导的下游信号通路，对多种2型免疫相关的炎性疾病具有很好的控制作用，如抑制哮喘气道炎症、气道高反应性和气道重塑的发生发展。目前，Dupilumab已经获批3项适应症，分别为哮喘、慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉和特应性皮炎。目前报道的Dupilumab生物学活性测定方法主要有ELISA、表面等离子共振(SPR)和细胞增殖抑制。ELISA和SPR虽然操作简单，灵敏度高，但不能提供生物学效应的信息，且方法耐用性和重复性较差；而细胞增殖抑制方法实验周期长，变异性大。随着抗IL-4单克隆抗体的快速发展，迫切需要一种特异性、高效、快速、准确的生物学活性检测方法。本专利技术通过构建HEK293-hSTAT6/5×STAT6-luc基因工程细胞株，开发了一种新的抗IL-4单克隆抗体生物学活性测定的方法，并研究该方法的专属性、准确性和精密度。该方法专属性强，准确性好，快速准确，可用于IL-4单克隆抗体的研制和质量控制。
技术实现思路
为了弥补现有技术的上述缺陷，本专利技术的目的之一在于提供一种能够用于快速简便地检测IL-4靶向治疗性抗体生物学活性的稳定细胞株。本专利技术的目的之二在于提供一种用于测定IL-4靶向治疗性抗体生物学活性的稳定细胞株的构建方法。本专利技术的目的之三在于提供一种快速简便、稳定准确的用于IL-4靶向治疗性抗体生物学活性检测的报告基因法(RGA)。本专利技术的上述目的通过以下技术方案实现：本专利技术的第一方面提供了一种能够用于快速简便地检测IL-4靶向治疗性抗体生物学活性的稳定细胞株。本专利技术的第二方面提供了一种用于测定IL-4靶向治疗性抗体生物活性的稳定细胞株的构建方法，所述方法包括以下步骤：将载体pSecCAG-hSTAT6-hygro和pGL4-5×STAT6-Luc-puro依次转染到细胞中，筛选后得到稳定细胞株。进一步，所述的转染载体的细胞为能够内源性表达IL-4Rα的HEK293细胞。进一步，所述的筛选后得到的稳定细胞株为稳定表达hSTAT6/5×STAT6-荧光素酶报告基因的稳定细胞株。在本专利技术的实施方案中，该构建方法包括，取HEK293细胞、950μF所述载体、电压220V条件下来转染所述HEK293细胞。本专利技术的第三方面提供了一种快速简便、稳定准确的用于IL-4靶向治疗性抗体生物学活性检测的方法，所述方法包括以下步骤：(1)按照本专利技术第二方面所述的构建方法构建本专利技术第一方面所述的稳定细胞株；(2)用IL-4刺激激活稳定细胞株中报告基因的表达；(3)再将IL-4靶向治疗性抗体药物作用于稳定细胞株；(4)测定报告基因信号值。进一步，步骤(4)中所述的测定报告基因信号值是通过向步骤(3)中加入荧光素酶底物后，根据得到的相对化学发光单位值(RLU)拟合四参数曲线来确定的。在本专利技术的实施方案中，步骤(1)中构建的稳定细胞株按照1×104-8×104个/mL的细胞密度进行接种，优选地，按照1×104个/mL的细胞密度接种。在本专利技术的实施方案中，所述方法还包括将步骤(1)中的稳定细胞株按照1×104-8×104个/孔的细胞密度制备成细胞悬液，优选地，按照4×104个/孔的细胞密度制备成细胞悬液。在本专利技术的实施方案中，步骤(2)中的IL-4刺激终浓度为1-20ng/mL；优选地，所述IL-4刺激终浓度为1ng/mL。在本专利技术的实施方案中，步骤(3)中所述IL-4靶向治疗性抗体药物包括Dupilumab、pascolizumab、pascolizumab、CBP-201、611，优选地，本研究选择了Dupilumab。在本专利技术的实施方案中，步骤(3)中IL-4靶向治疗性抗体药物的初始浓度为300μg/mL，等比例稀释的比例为1:2-1:5；优选地，等比例稀释的比例为1:3。在本专利技术的实施方案中，经步骤(3)处理的细胞在37℃，5％CO2的培养箱中孵育，孵育时间为2-24小时；优选地，所述孵育时间为6小时。在本专利技术的实施方案中，对优化后的IL-4靶向治疗性抗体生物学活性检测的方法进行验证，包括专属性、准确性和精密度的验证。进一步，所述专属性通过将HEK293-hSTAT6/5×STAT6-luc细胞、HEK293细胞、Dupilumab、变性Dupilumab和其他靶点的抗体同时用上述优化后的方法检测得到的结果来验证。进一步，所述的其他靶点的抗体包括：美泊利单抗(mepolizumab，靶点为IL-5)、纳武单抗(nivolumab，靶点为PD1)、托珠单抗(Tocilizumab，靶点为IL-6R)、利妥昔单抗(Rituximab，靶点为CD20)、巴利昔单抗(basiliximab，靶点为CD25)和英夫利昔单抗(靶点为TNFα)。在本专利技术的实施方案中，优化后的方法能够用于筛选IL-4靶向治疗性抗体药物。在本专利技术的实施方案中，在酶标仪上读取相对化学发光单位值(relativelightunit,RLU)通过数据处理拟合四参数曲线，根据得到的相对化学发光单位值拟合四参数曲线确定所述抗体的生物活性。四参数曲线，可反映出上下渐近线、IC50值和斜率等指标。优选为，使用SoftMax软件进行数据处理拟合四参数曲线。除非另有定义，本专利技术上下文中的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。此外，对部分术语解释如下。本文中使用的术语“IL-4”是指白细胞介素4，在人类中主要由活化T细胞产生。本文中使用的术语“HEK293-hSTAT6/5×STAT6-luc细胞”是指表达hSTAT6/5×STAT6-荧光素酶报告基因的HEK293细胞。本文中使用的术语“抗IL-4/IL-4R抗体”是指能够抑制IL-4/IL-4R通路信号转导的抗体，其通过与本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种稳定细胞株，其特征在于，所述细胞株稳定表达依赖STAT6活性的荧光素酶报告基因；/n优选地，所述细胞株稳定表达hSTAT6/5×STAT6荧光素酶报告基因；/n更优选地，所述细胞株包括HEK293。/n

【技术特征摘要】
1.一种稳定细胞株，其特征在于，所述细胞株稳定表达依赖STAT6活性的荧光素酶报告基因；
优选地，所述细胞株稳定表达hSTAT6/5×STAT6荧光素酶报告基因；
更优选地，所述细胞株包括HEK293。


2.根据权利要求1所述的稳定细胞株的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：将载体pSecCAG-hSTAT6-hygro和pGL4-5×STAT6-Luc-puro依次转染到细胞中，筛选后得到稳定细胞株。


3.一种用于测定IL-4靶向治疗性抗体药物生物学活性的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)按照权利要求2所述的构建方法构建权利要求1所述的稳定细胞株；
(2)用IL-4刺激激活稳定细胞株中报告基因的表达；
(3)再将IL-4靶向治疗性抗体药物作用于稳定细胞株；
(4)测定报告基因信号值；
优选地，所述IL-4靶向治疗性抗体药物包括Dupilumab、pascolizumab、pascolizumab、CBP-201、611；
更优选地，所述IL-4靶向治疗性抗体药物为Dupilumab。


4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将步骤(1)中的稳定细胞株按照1×104-8×104个/mL的细胞密度进行接种，优选地，按照1×104个/mL的细胞密度接种。


5.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：王军志，王兰，俞小娟，于传飞，王开芹，刘春雨，
申请(专利权)人：中国食品药品检定研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11